Summary
इस वीडियो को दर्शाता है कैसे फीडर सेल मुक्त परिस्थितियों में और कैसे लगातार फीडर में बीतने hESCs सेल मुक्त शर्तों मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) के विकास को बनाए रखने के लिए. HESC की पुष्टि pluripotency immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल मुक्त शर्तों फीडर में हो यह भी दिखा दिया है. 3 के भाग 2.
Abstract
इस वीडियो यह दर्शाता है कि कैसे विकसित करने के लिए माउस भ्रूण (MEF) फीडर fibroblast कोशिकाओं, MEF प्लेटों से पारित होने के hESCs के लिए कैसे मुक्त Matrigel प्लेटें फीडर सेल पर मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs).
Protocol
hESC संस्कृति दैनिक रखरखाव
- hESC संस्कृति मीडिया हर 24 बजे परिवर्तित किया जाना चाहिए. ES मीडिया शेयर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत बोतल से बाहर समाधान की राशि की जरूरत (~ 6 अच्छी तरह से थाली प्रति 20ml), 50ml बाज़ ट्यूब में जगह है, और 37 डिग्री सेल्सियस एक पानी के स्नान में गर्म रखना. एक बार मीडिया गरम है, 10ng/ml की अंतिम एकाग्रता के लिए 4 में संग्रहीत bFGF ° C जोड़ें. ° सी तुरंत उपयोग के बाद 4 में bFGF शेयर वापस रखो!
- 6 अच्छी तरह प्लेटें से सभी निकालें लेकिन 500μl मीडिया के ~. संस्कृति पकवान हटाने के लिए मलबे निलंबित ज़ुल्फ़ के लिए सुनिश्चित करें. सुनिश्चित करें कि hESC संस्कृति मीडिया में bFGF अच्छी तरह से मिश्रित है और ताजा मीडिया के 3ml 6 अच्छी तरह से एक थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए वापस जोड़. इनक्यूबेटर में थाली वापस रखो.
Matrigel पर MEFs से बंटवारे hESCs
आमतौर पर 1:3 MEFs पर hESCs मिला हुआ 6-अच्छी तरह से थाली तक 1:2 हो विभाजित कर सकते हैं Matrigel पर 6 अच्छी तरह प्लेटें कुओं मिला हुआ 4-5 दिन के बंटवारे के बाद फिर से बनने के साथ.
- जब Matrigel, MEF वातानुकूलित मीडिया (मुख्यमंत्री) पर बंटवारे hESCs pluripotency बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. MEF - वातानुकूलित मीडिया अग्रिम में किया जाता है. पहले दिन पर, 1.5 × 10 7 MEFs γ - विकिरणित T75 फ्लास्क में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. दूसरे दिन, MEFs कमरा 1 तापमान × पीबीएस, पीएच 7.4 के साथ एक बार धो रहे हैं, और तब ES 5ng/ml bFGF के साथ पूरक मीडिया के 15ml फ्लास्क जोड़ा जाता है. (नोट: MEFs छोटा या बड़ा बोतल में मढ़वाया जा सकता है, लेकिन सेल घनत्व और ES मीडिया की मात्रा के बीच अनुपात निरंतर होना चाहिए.) फ्लास्क 37 ° C पर एक और 24 घंटे के लिए incubated है. तीसरे दिन, मुख्यमंत्री एकत्र ताजा ES 5ng/ml bFGF के साथ पूरक मीडिया के 15ml के साथ बदल दिया. एकत्र मुख्यमंत्री 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है MEFs के एक चढ़ाना से MEF वातानुकूलित मीडिया लगातार सात दिनों में harvested रहे हैं 15 × 7 = 105ml उत्पन्न. सात दिनों के बाद, सभी मुख्यमंत्री भिन्न संयुक्त कर रहे हैं, बाँझ फ़िल्टर, aliquoted और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत मुख्यमंत्री के मीडिया तैयार के रूप में कर सकते हैं वर्णित संग्रहीत हो सकता है और 1 महीने के लिए इस्तेमाल किया.
- HESC बंटवारे से पहले एक दिन, 4 बजे Eppendorf ट्यूबों में Matrigel aliquots डिग्री सेल्सियस पिघलना करने के लिए रातोंरात डाल (एक विभाज्य Matrigel के 76.2mg शामिल है, और यह एक 6-अच्छी तरह से थाली के लिए आवश्यक राशि है). बंटवारे के दिन पर, एक 6-अच्छी तरह से थाली के लिए thawed Matrigel की एक शीशी ले, और बर्फ पर ठंड DMEM/F12 मीडिया की शीशी 6ml डाल दिया. DMEM/F12 मीडिया में Matrigel स्थानांतरण और मिश्रण अच्छी तरह से. 6 अच्छी तरह से एक थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए समाधान के 1ml जोड़ें. भंवर थाली Matrigel सतह पर वितरित करने के लिए और hESCs बंटवारे से पहले कम से कम 1 घंटा के लिए कमरे के तापमान पर Matrigel कवर प्लेट सेते हैं.
- MEFs पर hESCs 1 × Pbs, 7.4 पीएच के साथ एक बार धोया जाता है. इसके बाद गर्म collagenase चतुर्थ (1mg/ml) के 1ml 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जाता है और तब प्लेट 37 पर incubated है ° C 5-10 मिनट के लिए.
- BFGF के बिना ES मीडिया के 1ml प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें. थाली से स्टेम कोशिकाओं को उड़ाने 1ml विंदुक प्रयोग करें. सभी मीडिया एक 50ml बाज़ ट्यूब में hESCs और मृत MEFs के clumps युक्त लीजिए. चलो कोशिकाओं के बड़े clumps 5-10 मिनट के लिए व्यवस्थित इतना है कि hESC clumps ट्यूब के नीचे एक गोली फार्म जबकि MEFs सतह पर तैरनेवाला में निलंबित रहते हैं. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और resuspending hESC गोली ES मीडिया कमी bFGF, 200g में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर centrifugation द्वारा बाद का उपयोग करके धो.
- स्टेम कोशिकाओं Matrigel प्लेटों पर थाली करने के लिए, पहले कमरे DMEM/F12 तापमान (अच्छी तरह से प्रति 1ml) और के साथ पूरक प्रति अच्छी तरह से 10ng/ml bFGF मुख्यमंत्री के 2.5ml जोड़ने के साथ Matrigel प्लेटें धो लो. 10ng/ml bFGF, पिपेट सेल निलंबन ऊपर और नीचे कई बार साथ पूरक जब तक clumps वर्दी और आकार में छोटा हो गया है मुख्यमंत्री का एक उचित मात्रा में गोली Resuspend. 0.5ml अच्छी तरह से प्रति Matrigel प्लेट पर निलंबन विभाज्य. ध्यान दें कि Matrigel पर कॉलोनी घनत्व MEFs पर सामान्य बंटवारे द्वारा कालोनियों के घनत्व की तुलना में अधिक है. एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली प्लेस.
- Matrigel पर hESCs बनाए रखने के लिए, मुख्यमंत्री मीडिया 10ng/ml bFGF के साथ पूरक करने के लिए 4-5 दिन के लिए हर 24 बजे बदला है.
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Discussion
यह वीडियो बीतने hESCs MEF प्लेटों से कैसे सेल मुक्त फीडर Matrigel प्लेटों को दर्शाता है. ध्यान दें कि Matrigel पर कॉलोनी घनत्व MEFs पर सामान्य बंटवारे द्वारा कालोनियों के घनत्व की तुलना में अधिक है. Immunofluorescence और hESC Oct-4 और SSEA-4, जैसे pluripotency मार्करों, के लिए माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry धुंधला फीडर मुक्त संस्कृति की स्थिति में एक undifferentiated राज्य में hESCs के रखरखाव की पुष्टि करने की जरूरत हैं.
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Acknowledgments
Teitell प्रयोगशाला में मानव भ्रूण स्टेम सेल के अध्ययन से पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) बीज अनुदान RS1 ००,३१३ द्वारा समर्थित हैं. हम पुनर्योजी चिकित्सा और UCLA, विशेष रूप से डॉ. Amander क्लार्क, डॉ. जेरोम जैक, और UCLA ब्रॉड संस्थान हमारे अध्ययन के उनके समर्थन के लिए स्टेम सेल कोर सुविधा के सदस्यों में स्टेम सेल रिसर्च के ब्रॉड केंद्र के सदस्यों को धन्यवाद.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
