Summary
このビデオでは、フィーダー細胞を含まない条件とどのように継続的にフィーダー細胞を含まない条件で継代ヒトESにおけるヒト胚性幹細胞（ヒトES）の成長を維持する方法を示します。免疫蛍光顕微鏡法でフィーダー細胞を含まない条件で増殖させた多能性hESCの確認にも示されている。 3パート2。
Abstract
このビデオでは、どのようにMEFプレートからのフィーダー細胞を含まないマトリゲルプレートへ継代ヒトESへのマウス胚性線維芽細胞（MEF）をフィーダー細胞上のヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）、成長する方法を示します。
Protocol
ヒトES細胞の培養日常のメンテナンス
- ヒトES細胞の培養培地は、すべて24時間を変更する必要があります。 4℃で保存したESメディアストックボトルから、（6ウェルプレートあたり〜20ml）を必要な液量を、50ミリリットルファルコンチューブの場所、そして℃の水浴中で37に暖かいを取り出します。メディアが暖めされると、10ng/mlの最終濃度に4℃で保存されているbFGFを° Cを追加。 4でのbFGFの株式を元に戻します° C使用後はすぐに！
- すべてが、メディアの500μL〜に6 - ウェルプレートから取り外します。除去のための破片を中断するスワール培養皿に確認してください。ヒトES細胞培養培地中のbFGFは徹底的に混合され、6ウェルプレートの各ウェルに戻って新鮮な培地の3ミリリットルを追加してください。バックインキュベーター内でプレートを置く。
マトリゲル上のMEFから分裂ヒトES細胞
通常のMEF上でヒトES細胞のコンフルエント6ウェルプレートは6ウェルプレートにウェルは4-5日の分割後に再び合流になると、マトリゲルに1:3 1:2に分割することができます。
- マトリゲル、MEF -馴化培地（CM）に分割すると、ヒトES細胞は多能性を維持するために使用されている場合。 MEF -馴化培地は、事前に行われます。初日には、1.5 × 10 7γ線照射したMEFのはT75フラスコ中に播種されています。二日目は、MEFのは、室温1 × PBS、pH7.4で一回洗浄し、その後、5ng/mlのbFGFを添加したESメディアの15ミリリットルをフラスコに添加される。 （注：MEFのは、小さいまたは大きなフラスコに播種することができますが、細胞密度とESのメディアのボリュームの比率を一定にする必要があります。）フラスコをさらに24時間、37℃でインキュベートする。三日目に、CMは5ng/mlのbFGFを添加した新鮮なESのメディアの15ミリリットルを採取し、置換されます。収集されたCMは、4℃で保存されていますMEFのいずれかのめっきからMEF -馴化培地は、15 × 7 = 105ミリリットルを生成するための連続した7日間にわたって収穫されています。 7日後に、すべてのCMの画分を一緒にされ、滅菌濾過し、分注し、-20℃で保存のように調製したCMのメディアが保存され、1ヶ月に使用することができます。
- ヒトES細胞の分裂前のある日は、℃で一晩解凍する4でエッペンドルフチューブにマトリゲルのアリコートを入れて（一方のアリコートは、マトリゲルの76.2mg含まれている、とこれは1 6ウェルプレートに必要な量です）。分割の日に、1つの6 - wellプレートのために解凍マトリゲルの1バイアルを取る、氷の上に冷たいDMEM/F12メディアのバイアルと6ミリリットルを入れて。 DMEM/F12メディアにマトリゲルを移し、よく混ぜる。 6ウェルプレートの各ウェルに解決策の1ミリリットルを追加。渦巻板は、表面にマトリゲルを配布し、分割ヒトES細胞を前に、少なくとも1時間室温でマトリゲルで覆われたプレートをインキュベートする。
- MEFの上でヒトES細胞を1 × PBS、pH7.4で一回洗浄する。暖かいコラゲナーゼIV（1mg/ml）のその後1ミリリットルを6ウェルプレートの各ウェルに添加し、その後、プレートを37℃でインキュベートされた℃で5〜10分間。
- 各ウェルにbFGFをせずにESのメディアの1ミリリットルを追加。プレートから幹細胞を爆破する1ミリリットルピペットを使用してください。 50ミリリットルファルコンチューブにヒトESと死者MEFの塊を含むすべてのメディアを収集する。 MEFのは、上清中に浮遊したままでhESCの塊がチューブの底にペレットを形成するように細胞の大きな塊が5〜10分間のために解決しましょう。上清を捨て、5分間200グラムで、室温で遠心分離に続いて、bFGFを、欠けているESのメディアを使用してヒトES細胞ペレットを再懸濁することにより洗浄。
- プレートマトリゲルプレート上の幹細胞をするには、まず室温DMEM/F12（ウェル当たり1ミリリットル）とウェルあたり10ng/mlのbFGFを添加したCMの2.5ミリリットルを加えるとマトリゲルプレートを洗浄する。塊のサイズが均一で小さくなるまで上下に数回を10ng/mlのbFGFを添加したCM、ピペット細胞懸濁液の適切な量のペレットを再懸濁します。マトリゲルプレートのウェルあたり0.5ミリリットルでのアリコートはサスペンション。マトリゲル上でコロニーの密度がMEFの上に通常の分割により、コロニーの密度より高いことに注意してください。 37℃の組織培養インキュベーターでプレートを置きます。
- マトリゲル上でヒトES細胞を維持するために、10ng/mlのbFGFを添加したCMのメディアが4〜5日までの毎24時間に変更されます。
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Discussion
このビデオでは、どのように通過ヒトESへMEFプレートからのフィーダー細胞を含まないマトリゲルプレートに示しています。マトリゲル上でコロニーの密度がMEFの上に通常の分割により、コロニーの密度より高いことに注意してください。このようなOCT - 4およびSSEA - 4、などのhESCの多能性マーカー、のための免疫蛍光染色し、顕微鏡またはフローサイトメトリーは、フィーダーを含まない培養条件で未分化状態のヒトES細胞の維持を確認するために必要です。
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Acknowledgments
Teitellラボでヒト胚性幹細胞研究は再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）種子助成RS1 - 00313でサポートされています。我々は、UCLA、特に博士Amanderクラーク博士ジェロームザック、そして我々の研究の支援のためのUCLAのブロード研究所の幹細胞の中核施設のメンバーで、再生医療と幹細胞研究のブロードセンターのメンバーに感謝。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
