Summary
이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 2.
Abstract
이 동영상은 어떻게 MEF 플레이트에서 통과 hESCs에 피더 셀 - 무료 Matrigel 플레이트에 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
hESC 문화 일상 유지 보수
- hESC 문화 미디어는 모든 24 시간을 변경해야합니다. 4 ° C에 저장된 ES 미디어 주식 병에서 (6 잘 플레이트 당 ~ 20ml) 필요한 솔루션의 금액, 50ml 팰컨 관에서 개최하고, ° C 물 목욕 37에 따뜻한를 꺼내. 미디어가 따뜻하게되면 10ng/ml의 최종 농도가 4에 저장된 bFGF ° C를 추가합니다. ° C 즉시 사용 후 4 다시 bFGF 주식을 버려!
- 모든 6 자 접시에서 제거하지만, 미디어의 500μl를 ~. 소용돌이 제거 파편을 일시 중 지할 수있는 문화 접시를해야합니다. hESC 문화 미디어에서 bFGF가 철저하게 혼합되어 있는지 확인하고 6 자 판의 각 잘 돌아 신선한 미디어 3ml를 추가합니다. 인큐베이터에있는 플레이트 다시 꽂아.
Matrigel에 MEFs에서 분리 hESCs
보통 MEFs에 hESCs의 합류 6 자 판은 6 - 잘 접시는 우물이 4-5일 분리 후 다시 합류되고 함께 Matrigel에 1시 3분부터 1시 2분까지을 분할 수 있습니다.
- Matrigel, MEF - 냉방 미디어 (CM)에 분할 hESCs는 pluripotency 유지하는 데 사용됩니다 때. MEF - 냉방 미디어가 사전에 이루어집니다. 첫날, 1.5 × 10 7 γ - 반구 MEFs는 T75 플라스크에 씨앗을 품고 있습니다. 두 번째 날에는 MEFs는 실온 1 × PBS, pH를 7.4로 한 번 씻어하고 있으며, 다음 5ng/ml bFGF와 보충 ES 미디어의 15ml는 술병에 추가됩니다. (참고 : MEFs가 작은 또는 큰 flasks로 도금 수 있지만 세포 밀도와 ES 미디어의 볼륨 간의 비율이 일정해야합니다.) 플라스크가 다른 24 시간을위한 37 ° C에서 incubated입니다. 셋째 날, CM은 5ng/ml bFGF와 보충 신선한 ES 미디어 15ml로 수집 및 교체됩니다. 수집된 CM은 4 ° C.에 저장됩니다 MEFs 중 하나 도금에서 MEF - 냉방 미디어 15 × 7 = 105ml를 생성하기 위해 7 연패 일 동안 수확하고 있습니다. 7 일 후에 모든 CM의 분수가 결합되어, 살균, 여과 aliquoted 및 -20 ° C.에 저장된 저장하고 1 달 동안 사용할 수 설명된 CM 미디어가 준비했습니다.
- hESC 분리하기 전에 어느 날, ° C는 하루 해동 4에서 eppendorf 튜브에 Matrigel의 aliquots 넣어 (한 나누어지는가 Matrigel의 76.2mg가 포함되어 있으며,이 하나의 6 - 플레이트 잘에 필요한 금액입니다.) 분할의 날, 한 6 자 접시 해동 Matrigel 중 하나 약병을 얼음에 차가운 DMEM/F12 미디어의 병을과 6ml를 넣어. DMEM/F12 미디어에 Matrigel을 전송하고 잘 섞는다. 6 잘 접시의 각각 잘 수있는 솔루션의 1ml을 추가합니다. 소용돌이 플레이트 표면에 Matrigel을 배포하고 분할 hESCs 전에 적어도 1 시간을 위해 실내 온도에서 Matrigel - 커버 플레이트를 부화.
- MEFs에 hESCs는 1 × PBS, pH를 7.4로 한번 세탁하고 있습니다. 따뜻한 collagenase IV (1mg/ml)의 이후 1ml는 6 잘 플레이트의 각 잘에 추가되고 다음 판은 37 incubated 수 있습니다 ° C를 50-10 분.
- 각 잘하는 bFGF없이 ES 미디어의 1ml을 추가합니다. 접시에서 줄기 세포를 날려 버릴 1ml 피펫을 사용합니다. 50ml 매는 튜브로 hESCs과 죽은 MEFs의 대단히 짧은 시간을 포함하는 모든 미디어를 수집합니다. MEFs가 뜨는에 정지 상태 동안 hESC의 대단히 짧은 시간이 튜브 하단의 펠렛을 형성 있도록 세포의 먼지 입자들이 큰 덩어리 5-10 분 정착하자. 뜨는을 취소하고, 5 분 200g에 실온에서 원심 분리 다음 bFGF을 부족한 ES 미디어를 사용하여 hESC 펠렛을 resuspending로 씻으십시오.
- 판 Matrigel 접시에있는 줄기 세포를하려면 먼저 실온 DMEM/F12 (물론 당 1ml)과 잘 따라 10ng/ml bFGF와 보충 CM의 2.5ml을 추가로 Matrigel 접시를 씻으십시오. 대단히 짧은 시간이 균일하고 크기가 작은이 될 때까지 10ng/ml bFGF, 피펫 세포 현탁액 위아래로 몇 시간을 보충 CM의 적절한 볼륨으로 펠렛을 Resuspend. Matrigel 접시 잘 당 0.5ml로 나누어지는 정지합니다. Matrigel에 식민지 밀도가 MEFs에 대한 일반적인 분할하여 식민지의 밀도보다 높은됩니다. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- Matrigel에 hESCs을 유지하려면, 10ng/ml bFGF와 함께 보충 CM 미디어는 최대 4-5일하는 모든 24 시간을 변경합니다.
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Discussion
이 동영상은 어떻게 통과 hESCs에 MEF 플레이트에서 피더 셀 - 무료 Matrigel 번호판을 보여줍니다. Matrigel에 식민지 밀도가 MEFs에 대한 일반적인 분할하여 식민지의 밀도보다 높은됩니다. 그러한 월 4 SSEA - 4로 hESC pluripotency 마커에 대한 Immunofluorescence 염색법과 현미경이나 흐름 cytometry는 피더 무료 문화 조건에 undifferentiated 상태에서 hESCs의 유지를 확인하기 위해 필요합니다.
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Acknowledgments
Teitell 연구실에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 UCLA, 특히 박사 Amander 클라크 박사 제롬 잭, 우리의 연구들의 지원 UCLA 브로드 연구소 줄기 세포 핵심 시설의 멤버에 재생 의료 및 줄기 세포 연구의 브로드 센터의 회원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
