Summary
В этом видеоролике показано, как поддержать рост человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в фидер бесклеточных условиях и как непрерывно прохождения ЭСК в питатель бесклеточных условиях. Подтверждение чЭСК плюрипотентности, выращенные в питатель бесклеточных условиях с помощью иммунофлуоресценции микроскопии также продемонстрирована. Часть 2 из 3.
Abstract
В этом видеоролике показано, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерных клеток, как проход ЭСК из плит MEF фидерными бесклеточной пластин Матригель.
Protocol
чЭСК культуру ежедневного обслуживания
- СМИ чЭСК культуры необходимо менять каждые 24 часов. С фондового ES СМИ бутылку хранить при температуре 4 ° С, вынуть количество раствора необходимо (~ 20 мл на 6-луночный планшет), место в 50 мл трубки сокол, и теплая до 37 ° С на водяной бане. Как только СМИ подогревают, добавляют bFGF хранить при температуре 4 ° С до конечной концентрации 10ng/ml. Положите фондовом bFGF назад на 4 ° С сразу же после использования!
- Удалить из 6-луночных все, но ~ 500 мкл средств массовой информации. Убедитесь, что вихревые культуры блюдо приостановить мусора для удаления. Убедитесь в том, bFGF в СМИ чЭСК культуры тщательно перемешивают и добавляют 3 мл свежей среды обратно в каждую лунку 6-луночный планшет. Положите пластину обратно в инкубатор.
Разделение ЭСК из MEFs на Матригель
Обычно сливной 6-луночный планшет из ЭСК на MEFs можно разделить 1:2 до 1:03 на Матригель 6-луночных планшетах с скважинах становится вырожденным снова через 4-5 дней после расщепления.
- При разделении ЭСК на Матригель, MEF-кондиционированной среде (СМ) используется для поддержания плюрипотентности. MEF-кондиционированной среде сделана заранее. В первый день, 1,5 × 10 7 γ-облученных MEFs высевают в колбы T75. На второй день, MEFs моют один раз при комнатной температуре 1 х PBS, рН 7,4, а затем 15 мл ES среде с 5ng/ml bFGF добавляется в колбу. (ПРИМЕЧАНИЕ: MEFs могут быть покрыты на меньшие или большие колбы, но соотношение между плотностью клеток и объема средств массовой информации ES должна быть постоянной.) Колбу инкубировали при 37 ° C в течение еще 24 часов. На третий день, CM собирается и заменены 15 мл свежего СМИ ES дополнен 5ng/ml bFGF. Собранных CM хранится при температуре 4 ° C. MEF-кондиционированной среде от одного обшивки MEFs собирают в течение семи дней подряд для получения 15 × 7 = 105ml. После семи дней все CM фракции объединяют, стерильно фильтруют, аликвоты и хранили при температуре -20 ° C. CM СМИ получают, как описано могут быть сохранены и использованы в течение 1 месяца.
- За день до чЭСК расщепления, положить Матригель аликвоты в пробирки Эппендорф при 4 ° С до оттепели ночь (один содержит аликвоту 76.2mg из Матригель, и это количество, необходимое для одного 6-луночный планшет). В день расщепления, возьмите один флакон талой Матригель за один 6-луночного планшета, положите флакон и 6 мл холодной DMEM/F12 СМИ на льду. Передача Матригель в DMEM/F12 СМИ и хорошо перемешать. Добавить 1 мл раствора в каждую лунку по 6-луночный планшет. Swirl пластины распространять Матригель на поверхность и инкубировать Матригель покрытые планшет при комнатной температуре в течение 1 часа до расщепления ЭСК.
- ЭСК на MEFs моют один раз с 1 х PBS, рН 7,4. Впоследствии 1 мл теплой коллагеназы IV (1mg/ml) добавляется в каждую лунку 6-луночного планшета, а затем пластины выдерживают при температуре 37 ° С в течение 5-10 мин.
- Добавить 1 мл СМИ ES без bFGF в каждую лунку. Используйте 1 мл пипетки, чтобы взорвать стволовых клеток от пластины. Соберите все среды, содержащие сгустки ЭСК и мертвых MEFs в 50 мл трубки сокола. Давайте большие скопления клеток урегулировать в течение 5-10 мин, так что чЭСК сгустки форме гранул на дне пробирки в то время как MEFs остаются взвешенными в супернатант. Удалите супернатант и стирать ресуспендированием чЭСК осадок в ES средах без bFGF, с последующим центрифугированием при комнатной температуре в 200 г в течение 5 мин.
- Для пластины стволовых клеток на Матригель пластин, первой стирки Матригель пластин с комнатной температуре DMEM/F12 (1 мл на лунку) и добавление 2,5 мл СМ дополнена 10ng/ml bFGF на лунку. Ресуспендируют пеллет в соответствующий объем СМ дополнена 10ng/ml bFGF, пипетка клеточной суспензии вверх и вниз несколько раз, пока скопления стал однородным и небольшого размера. Алиготе подвески на 0,5 мл на лунку на Матригель пластины. Обратите внимание, что колония плотности на Матригель выше, чем плотность колоний обычными расщепления на MEFs. Место пластины в 37 ° C культуре ткани инкубатора.
- Для поддержания ЭСК на Матригель, CM среде с 10ng/ml bFGF меняется каждые 24 часов до 4-5 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это видео демонстрирует отрывок из ЭСК MEF пластин для фидерных бесклеточной пластин Матригель. Обратите внимание, что колония плотности на Матригель выше, чем плотность колоний обычными расщепления на MEFs. Иммунофлуоресцентного метода и микроскопии или проточной цитометрии для чЭСК плюрипотентности маркеров, таких как Oct-4 и SSEA-4, необходимы, чтобы подтвердить поддержания ЭСК в недифференцированное состояние, в фидерных условиях свободного культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Человека эмбриональных стволовых клеток исследований в лаборатории Teitell поддерживаются Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) семена грант RS1-00313. Мы благодарим членов Широкий Центр регенеративной медицины и исследований стволовых клеток в Лос-Анджелесе, особенно доктор Amander Кларк, д-р Джером Зак, и члены UCLA Broad Institute стволовых клеток Основные фонда за поддержку наших исследований.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
