Summary
이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다. 3 부 3.
Abstract
이 동영상은 피더 세포가없는 조건에서 어떻게 피더에서 연속 통과 hESCs 세포가없는 조건에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)의 성장을 유지하는 방법을 보여줍니다. hESC의 확인은 pluripotency immunofluorescence 현미경으로 피더 셀없는 조건을 재배도 증명됩니다.
Protocol
Matrigel에서 Matrigel을 분리 hESCs
보통 Matrigel에 hESCs의 합류 6 잘 판은 우물이 4-5일 분리 후 다시 합류되기와 다른 Matrigel 판에 1시 5분에서 1시 3분까지 분할 수 있습니다.
- 분할하기 전에 위에서 설명한 CM과 Matrigel 플레이트는 준비가되어 있습니다.
- 분할 당일, × 1 분리를위한 PBS, pH7.4를 각각 잘 씻어 각각 잘하는 1mg/ml Dispase (DMEM/F12 매체와 희석 5mg/ml 재고 솔루션)의 1ml을 추가하고, 37 품어 ° C 3 분.
- 1 각 잘 세 번 씻어 × PBS, pH7.4은, bFGF없이 ES 미디어 1ml를 추가 우물의 바닥에서 식민지를 긁어 세포 스크레이퍼를 사용하여 50ml 팔콘 튜브의 정지 hESCs를 수집하고, 원심 분리에 의해 펠릿 200g에 상온에서 5 분.
- 다시 타석으로 Matrigel 플레이트에 hESCs 먼저 DMEM/F12과 Matrigel 접시를 씻어 잘 당 10ng/ml bFGF와 보충 CM의 2.5ml를 추가합니다. 10ng/ml bFGF, 피펫 세포 현탁액 위, 아래로 세 번 함께 보충 CM의 적절한 볼륨에 hESC 펠렛을 Resuspend. (참고 : 분리를위한 hESCs가 Matrigel 접시에서 온 때, 대단히 짧은 휴식을 매우 쉽게 않으므로 pipetting 3 번을 충분하고 더 식민지를 오버 방해와 단일 세포를 만들 수 있습니다 pipetting.) 나누어지는은 당 hESC의 대단히 짧은 시간 서스펜션 0.5 ML 잘 6 잘 Matrigel 판의 최종 볼륨으로 당 3ml 잘 달성하기 위해. 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다.
immunofluorescence 현미경에 의해 pluripotency 마커 감지
Immunofluorescence 현미경은 culturing 동안 hESC pluripotency 마커 월 4 SSEA - 4의 표현을 확인하는 데 사용됩니다.
- 잘 하나에서 미디어를 기음과 1 × PBS 세척, 산도 7.4. 10 분에 대한 수정을 잘하기 위해 3.7 %의 포름 알데히드 2ml를 추가합니다.
- 두 분 -20에서 잘과 장소 ° C에 2ml 메탄올을 추가 1xPBS, pH를 7.4로 씻어.
- 5 분 알부민 0.2 % 소 serume (BSA)의 1ml와 1xPBS, 산도 7.4, 그리고 블록 린스.
- 월 4 anti-h/mSSEA-4 항체 (0.2 % BSA에 1:200 희석)의 1ml을 추가하고, 1 시간 또는 4 ° C에서 하룻밤 실온에서 알을 품다. (참고 : SSEA - 4 염색법을위한 6 단계로 바로 진행합니다)
- , 1xPBS, pH를 7.4로 세 번 씻어 FITC - 복합 토끼 IgG (0.2 % BSA에 1:500 희석), 그리고 1 시간에 대한 실온에서 부화를 추가합니다.
- 1xPBS, 산도 7.4 3 번 씻어하고 잘의 중심에 (핵 시각화가 원하는 경우 DAPI를 포함할 수 있습니다) 장착 솔루션의 한 방울을 넣어. 매니큐어와 인감, 세포의 상단에 coverslip을 넣어, 그리고 immunofluorescence 현미경에 의해 평가합니다.
인간 배아 줄기 세포 영수증
ES 미디어 (배아의 줄기 세포 미디어) :
DMEM/F12 - 400ml
마네 세럼 Replacer - 100ml
비 - 필수 아미노산 - 5ml
200mM GlutaMax / BME 솔루션 - 5ml
페니실린 / 스트렙토 마이신 - 5ml
4 잘 섞어 500ml 병의 최종 hESC 문화 미디어를 저장 ° C. 2 주간 최대 좋아.
MEF 문화 미디어 :
DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
비 - 필수 아미노산 - 10ml
글루타민 - 10ml
Penicllin / 스트렙토 마이신 - 10ml
잘 믹스 4에서 최종 MEF 문화 미디어를 저장 ° C.
200mM Glutamax / BME 솔루션 :
Glutamax - 100ml
β - 메르 캅 토 에탄올 (14.3M에 증권 솔루션) - 140 μ1
이 잘 그리고 솔루션 나누어지는의 10ml의 일부를 섞는다. -20 ° C.에 aliquots 유지
bFGF 솔루션 (재고의 최종 농도 : 10 마이크로 그램 / ML) :
bFGF (FGF2) - 50 μg
1xPBS에 0.1 % BSA, 산도 7.4 - 5ml
10 μg / ML 주식을하기 위해 5ml 0.1 % BSA에 bFGF 50 마이크로 그램을 디졸브. 500 μl 부분으로 나누어지는. -80에서 보관 ° C.
Collagenase IV 솔루션 (1mg/ml) :
Collagenase IV - 50mg
DMEM/F12 미디어 - 50ml
50ml 팰컨 튜브에 collagenase IV 가루를 추가합니다. 후드에서 무균 DMEM/F12 미디어 50ml에 섞는다. <1 분 소용돌이 솔루션입니다. 가루가 해산되어 있는지 확인합니다. 후드에서 새 살균 50ml 팔콘 튜브에 필터 0.22 μm의 통과. 이 솔루션은 4 저장된 이주의 최대 ° C.에 좋습니다
Dispase 솔루션 (1mg/ml) :
Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 미디어 - 8ml
-20 ° C.에서 나누어지는 상업 5mg/ml의 Dispase 솔루션과 저장 DMEM/F12를 사용 1mg/ml로 dispase을 희석. 이 솔루션은 4에서 1 주일 동안 보관 가능 ° C.
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Discussion
3 동영상이 시리즈는 (MEF) 피더 세포 (비디오 1) 어떻게 통로를 피더 셀 - 무료 접시 (비디오 2) Matrigel을하고, 방법을 유지하기 위해 마우스 배아 fibroblast에서 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다 Matrigel 피더 셀 무료 조건 (동영상 3) passaging하여 hESCs. 많은 이전의 연구는 실용적, undifferentiated hESCs의 유지 보수가 inactivated MEF 피더 세포에 대한 문화를 필요로했다. 그러나 대부분의 실험, 피더 세포 오염의 무료 hESCs의 순수한 인구가 필요합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 우리는 어떻게 통과 hESCs에 MEF 피더 플레이트에서 피더 셀 - 무료 Matrigel 플레이트 및 유지하고 피더에서 연속 통과 hESC 식민지 세포가없는 조건을 증명하고있다. 이 프로토콜에 따라, MEF 피더 셀 오염의 작은 금액은 아직 Matrigel의 접시에 통로 하나가 존재할 수 있지만,이 오염 물질은 일반적으로 시각화하기 쉽습니다. 이상 Matrigel 통로 둘 때, 아무 MEF 오염은 일반적으로 실험에 대한 hESCs의 순수한 인구를 떠나 발견되지 않습니다. 그러한 월 4 SSEA - 4로 hESC pluripotency 마커에 대한 Immunofluorescence 염색법과 현미경이나 흐름 cytometry는 문화 중에 undifferentiated 상태에서 hESCs의 유지를 확인하기 위해 필요합니다.
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Acknowledgments
Teitell 연구실에서 인간 배아 줄기 세포 연구는 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM) 씨앗 부여 RS1 - 00313에 의해 지원됩니다. 우리는 UCLA, 특히 박사 Amander 클라크 박사 제롬 잭, 우리의 연구들의 지원 UCLA 브로드 연구소 줄기 세포 핵심 시설의 멤버에 재생 의료 및 줄기 세포 연구의 브로드 센터의 회원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
