स्थिर ट्रांसजेनिक सी. Microinjection का उपयोग एलिगेंस पीढ़ी

Summary

इस वीडियो सी एलिगेंस जननपिंड ट्रांसजेनिक जानवर बनाने में microinjection की तकनीक को दर्शाता है.

Abstract

ट्रांसजेनिक Caenorhabditis एलिगेंस जननपिंड ¹ में एक डीएनए प्लाज्मिड समाधान के microinjection के माध्यम से आसानी से बनाया जा सकता है . प्लास्मिड डीएनए के लिए extrachromosomal concatamers कि stably कर रहे हैं, हालांकि वास्तविक ² गुणसूत्रों के रूप में एक ही दक्षता के साथ विरासत में मिली नहीं फार्म rearranges. ब्याज की एक जीन है rol-6 या GFP के रूप में एक स्पष्ट प्ररूपी मार्कर के साथ सह इंजेक्शन, एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत ट्रांसजेनिक जानवरों के चयन की अनुमति है. exogenous जीन सेलुलर स्थानीयकरण अध्ययन के लिए अपने देशी प्रमोटर से व्यक्त किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, transgene है कि विशेष रूप से सेल या ऊतकों में जीन उत्पाद की भूमिका का आकलन करने के लिए एक अलग विशिष्ट ऊतक प्रमोटर द्वारा संचालित किया जा सकता है है. इस तकनीक कुशलतापूर्वक germline या जल्दी ³ भ्रूण के अलावा सी एलिगेंस के सभी ऊतकों में जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव. ट्रांसजेनिक जानवरों के निर्माण में व्यापक रूप से प्रयोगात्मक मानदंड की एक श्रृंखला के लिए उपयोग किया जाता है. यह वीडियो microinjection ट्रांसजेनिक कीड़े उत्पन्न प्रक्रिया को दर्शाता है. इसके अलावा, चयन और स्थिर ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस लाइनों के रखरखाव में वर्णित है.

Protocol

अभिव्यक्ति प्लाज्मिड निर्माण

दो plasmids आवश्यक हैं: एक ऊतक विशेष हित के जीन की अभिव्यक्ति और चयन परिवर्तन मार्कर के रूप में एक दूसरे के लिए.

प्रायोगिक प्लाज्मिड

1. प्रमोटर है कि ब्याज की / ऊतक कोशिका प्रकार, उदाहरण के लिए, एक तंत्रिका या मांसपेशी विशिष्ट प्रमोटर में व्यक्त किया है का चयन करें. यदि एक ही ऊतक के भीतर कई जीनों व्यक्त की है, एक प्रमोटर कैसेट गेटवे प्रणाली (Invitrogen) में प्लाज्मिड इस्तेमाल किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण recombinational क्लोनिंग ⁴ द्वारा प्रमोटर के हित बहाव के किसी भी जीन की प्रविष्टि की अनुमति देता है आम तौर पर, अपस्ट्रीम दृश्यों के 2-5 केबी सही और सटीक ^{अभिव्यक्ति} के लिए पर्याप्त है.
   
   
2. हित के जीन की सीडीएनए दो मायनों में क्लोन किया जा सकता है है:
   1. पारंपरिक क्लोनिंग प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग.
   2. गेटवे क्लोनिंग के लिए, यह है पीसीआर प्राइमरों कि गेटवे att बी recombinational अनुक्रम होते का उपयोग प्रवर्धित . प्रवर्धित सीडीएनए पहले दाता वेक्टर pDONR201 प्रविष्टि वेक्टर बनाने में recombined है और फिर ई. में तब्दील कोलाई तनाव DH5a. सफल recombinants और मिनी प्रस्तुत करने का डीएनए के अलगाव के चयन के बाद, प्रविष्टि वेक्टर प्रमोटर युक्त गंतव्य सदिश अभिव्यक्ति प्लाज्मिड बनाने में recombined है. Recombinational क्लोनिंग पर विवरण या तो Invitrogen गेटवे पुस्तिका से या काल्डवेल एट अल में उपलब्ध हैं ^5..

चयन प्लाज्मिड मार्कर

ट्रांसजेनिक मार्कर plasmids के उदाहरण rol-6 या शरीर दीवार मांसपेशी प्रमोटर unc 54 का उपयोग करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति ड्राइव शामिल हैं. ये मार्कर plasmids आमतौर पर अनुसंधान समुदाय के भीतर से अनुरोध पर उपलब्ध हैं.

सी. एलिगेंस के Microinjection

तैयार

1. दो plasmids कि इंजेक्शन जा रहे हैं डीएनए अलगाव प्रदर्शन. उन्हें quantitate और 50 एनजी / μl प्रत्येक के एक 1:1 के अनुपात में एक साथ मिश्रण.
   
   
2. अगर पैड तैयार:
   1. पानी में एक 2% agarose समाधान करें, गर्मी या माइक्रोवेव जब तक भंग.
   2. एक benchtop पर कई 22 x 50 मिमी को कवर चश्मा सेट करें.
   3. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग, एक कांच कवर पर पिघला agarose की एक बूंद जगह और तुरंत ड्रॉप से ​​अधिक एक 90 कोण पर एक दूसरे कांच कवर करने के लिए पहली जगह है. कई अन्य कवर चश्मे के लिए दोहराएँ. agarose के चपटे डिस्क के व्यास 15-20 मिमी के बीच होना चाहिए.
   4. Agarose (इस क्षणों लेता है केवल) के बाद जम गया है, कांच कवर हटाने और पैड के लिए पूरी तरह से शुष्क हवा की अनुमति (रात भर के लिए कई घंटे).
   5. कमरे के तापमान पर एक कवर गिलास बॉक्स में पैड का स्टोर.
      
      
3. डीएनए समाधान के लिए सुई लोडर:
   
   सुई लोडर 100 μl केशिका ट्यूब है कि बीच में एक खुला लौ पर गरम कर रहे हैं और तेजी से लगभग दो बार उनकी लंबाई खींच से बनाया जाता है. दो हिस्सों के अलावा तोड़ रहे हैं एक बार केशिका ट्यूब ठंडा. 10-20 इंजेक्शन के लिए सुई लोडर संचय. एक microcentrifuge ट्यूब रैक में ईमानदार स्टोर. सावधानी के रूप में अपने अंक पर नहीं कोचना.
   
   
4. Microinjection सुइयों करें:
   
   सुई एक विशेष केशिका ट्यूब कि एक आंतरिक गिलास फिलामेंट शामिल से बना है, इस फिलामेंट डीएनए समाधान के लिए एक बाती के रूप में कार्य करता है. ये एक मशीन सुई खींचने पर खींच रहे हैं. हम 24.8 के एक गर्मी की स्थापना के साथ एक Narishige पीपी 830 खींचने का उपयोग करें. कई सुई एक बार में खींच रहे हैं और एक छोटे से प्लास्टिक बॉक्स में संग्रहित कर रहे हैं. आसानी से एकाधिक सुइयों किया जा सकता है "आरोहित" लंबी अवधि के भंडारण के लिए क्ले मॉडलिंग की एक पट्टी पर.
   
   
5. सुई टिप "तोड़ने":
   
   microinjection सुई की नोक इतना ठीक है कि यह वास्तव में यह अंत में बंद कर दिया है खींचा है और खुला टूट जाना चाहिए कवर कांच के छोटे shards का उपयोग. इन में एक कागज तौलिया में एक 18 x 18 मिमी कवर कांच लपेटकर और धीरे जब तक यह कई टुकड़ों में टूट जाता है दबाव लागू करने के द्वारा तैयार कर रहे हैं. एक उपयोगी आकार के shards लगभग 3 4 मिमी x.
   
   
6. मानक प्रक्रियाओं ⁶ का उपयोग इंजेक्शन के लिए जल्दी वयस्क चरण के लिए जंगली प्रकार के कीड़े (N2) आगे बढ़ें . के बारे में 100 तैयार ठीक से कीड़े के मंचन / इंजेक्शन का निर्माण.

प्रक्रिया

1. एक हीलियम टैंक है कि एक microinjection सुई हाथ और धारक से जुड़ा है पर मुख्य वाल्व खोलें. नियामक वाल्व बंद गैस लाइन में प्रवेश करने के लिए, 35 साई को दबाव में लाने की अनुमति है. सूचना है कि गैस की एक पैर पेडल का उपयोग जारी किया जा सकता है.
   
   
2. एक मानक मुँह pipetter टयूबिंग (गिलास केशिका ट्यूब के कंटेनर में पाया) में एक सुई लोडर डालें और प्लाज्मिड मिश्रण (~ 1 μl) की एक छोटी राशि आकर्षित.
   
   
3. सुई लोडर ध्यान से एक इंजेक्शन की सुई के पीछे के अंत में रखा गया है और धीरे से की लंबाई के माध्यम से सभी तरह डालाप्रतिरोध जब तक सुई लगा है. धीरे से उड़ाने की डीएनए समाधान निष्कासित, तो लोडर हटा दें.
   
   
4. Microinjection हाथ में सुई डालें, छोटे आंतरिक रबर गैसकेट के भीतर जगह करने के लिए सावधान किया जा रहा है.
   
   
5. सुई तोड़ने कवर कांच का ठीकरा एक अगर पैड के एक किनारे पर रखें. ठीकरा, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अगर पैड की पूरी सतह हेलोकार्बन तेल के साथ, कवर. एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर अगर पैड रखें.
   
   
6. देखने 4X उद्देश्य और चमकदार क्षेत्र की रोशनी का उपयोग क्षेत्र के केंद्र में सुई की स्थिति है, लेकिन यह तेल में अभी तक कम नहीं. इसके अलावा, केंद्र में कवर कांच का ठीकरा के भीतर बढ़त की स्थिति है, तो उस पर ध्यान केंद्रित (अभी भी 4X उद्देश्य का उपयोग). तेल में सुई लोअर, यह कवर कांच का ठीकरा के रूप में एक ही फोकल हवाई जहाज़ में लाने. 40x उद्देश्य के लिए स्विचन द्वारा बढ़ाई उठाएँ. ठीकरा के किनारे पर refocus और सुई की नोक reposition, यदि आवश्यक है.
   
   
7. इंजेक्शन सुई की नोक खुला है, धीरे कवर कांच ठीकरा के किनारे के खिलाफ सुई कुहनी से हलका धक्का है, जबकि एक ही समय में पैर पेडल के माध्यम से गैस की एक छोटी नाड़ी आवेदन. सुई पर्याप्त खुला टूट जाएगा जब तरल के छोटे बूंदों सुई के अंत से बच. अतिरिक्त तरल प्रवाह बहुत बड़ी एक खोलने के कारण वांछनीय नहीं है, के रूप में यह जानवरों को मार देगा.
   
   
8. मंच से सुई जुटाने द्वारा अगर पैड, निकालें लेकिन एक्स या Y-अक्ष की स्थिति को बदल नहीं है. चरण सुई के नीचे से बाहर स्लाइड, अगर पैड को हटा दें और इसे एक विदारक माइक्रोस्कोप पर जगह. पैड पर तेल की सतह के नीचे एक कीड़ा, स्थानांतरण. यदि कीड़ा wriggles, धीरे स्ट्रोक यह जब तक यह अगर पैड संपर्कों. नम कीड़ा सूखी agarose का पालन करना चाहिए.
   
   
9. इंजेक्शन
   1. जल्दी मंच पर अगर पैड वापस जगह है, देखने के क्षेत्र में कीड़ा केंद्रित.
   2. कृमि के रूप में ध्यान की एक ही विमान में सुई लोअर.
   3. हॉफमैन प्रदीप्ति (विपरीत फिल्टर का एक प्रकार) के लिए फिल्टर स्विच करें. इस कृमि के रूपात्मक विस्तार दिखाई बनने के लिए अनुमति देता है. यदि Nomarski / डीआईसी प्रकाशिकी उल्टे गुंजाइश है कि रूप में अच्छी तरह से काम करेगा पर उपलब्ध हैं. 40x उद्देश्य का प्रयोग, "दानेदार" कीड़ा जननपिंड syncytial केंद्र, रोगाणु नाभिक "मधुकोश" पैटर्न से नीचे (चुन जो भी जननपिंड सुई का सामना करना पड़ रहा कीड़ा के किनारे पर तैनात है) पर ध्यान केंद्रित.
   4. ठीक सुई की स्थिति जब तक टिप ध्यान में भी (जननपिंड "graininess" के रूप में एक ही विमान) धुन.
   5. धीरे जननपिंड के केंद्र में सुई डालने और जननपिंड हाथ में डीएनए के एक या दो छोटी बूंद निष्कासित गैस के दबाव के एक संक्षिप्त पल्स लागू. आप बाहर का जननपिंड भर में तरल प्रसार की एक लहर का पालन करना चाहिए. लगता है अधिक तरल बेहतर है, के बाद से बहुत अधिक तरल जननपिंड हाथ के प्रॉक्सिमल मोड़ है, जो नीचे oocyte उत्पादन बंद कर सकते हैं में प्रवाह कर सकते हैं मत करो. यदि संभव हो तो, कृमि की स्थिति पर निर्भर करता है, एक ही तरीके से अन्य जननपिंड हाथ इंजेक्षन.
   6. यह करने के लिए जल्दी से काम करते हुए एक कीड़ा इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में यह आसानी से कुम्हलाना कर सकते हैं. दूसरा जननपिंड हाथ इंजेक्षन करने के लिए निर्णय कैसे जल्दी आप सुई और कीड़ा स्थिति कर सकते हैं पर निर्भर है. पूरी प्रक्रिया को आदर्श कम से कम 1-2 मिनट ले जाना चाहिए.
      
      
10. मंच से कांच कवर निकालें और यह एक विदारक गुंजाइश पर जगह है. M9 बफर के 1μl (22mm के.एच. _{2 4} पीओ 42mm ना HPO _{2 4,} 85mm NaCl, 1mm MgSO ₄₎ इंजेक्शन कीड़ा पर सीधे लागू करें (इस हेलोकार्बन तेल की सतह के नीचे विंदुक टिप submerging आवश्यक हो सकता है). बफर कीड़ा rehydrate चाहिए, यह तो बंद agarose पैड सतह फ्लोट जाएगा. एक नियमित रूप से एक कीड़ा लेने का उपयोग कर थाली में कीड़ा स्थानांतरण. agarose पैड कई गुना अधिक reused किया जा सकता है जब तक यह भी संतृप्त बफर और अब कोई पालन कीड़े के साथ बन गया है.

ट्रांसजेनिक चयन

1. इंजेक्ट कीड़े, पी ₀ पीढ़ी, व्यक्तिगत, ताजा, bacterially वरीयता प्राप्त प्लेटें (60 मिमी) को हस्तांतरित कर रहे हैं और पुन: पेश करने की अनुमति दी. आमतौर पर, इंजेक्शन पशुओं के रूप में 20 ° C पर 2-3 दिनों के लिए incubated रहे हैं जब तक संतानों दिखाई.
   
   
2. एफ ₁ वंश ट्रांसजेनिक मार्कर (जैसे प्रतिदीप्ति के रूप में) एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope उपयोग के सबूत के लिए मनाया जाता है. प्रत्येक फ्लोरोसेंट, ₁ एफ _{वाहक,} पशु अलग एक नई प्लेट पर क्लोन है (प्रत्येक ₁ एफ से संतानों के बाद से एक अलग लाइन माना जाता है ). एफ ₁ hermaphrodites को पुन: पेश करने की अनुमति दी जाती है. फिर, यह आम तौर पर 20 डिग्री 2-3 दिनों के लिए सी है पर प्रदर्शन किया जब तक संतानों दिखाई.
   
   
3. एफ ₂ पीढ़ी के रूप में अच्छी तरह से ट्रांसजेनिक जानवरों के लिए मनाया जाता है. एफ ₂ जानवरों है कि विरासत में मिला है और ट्रांसजेनिक सरणी व्यक्त एक "स्थिर" रेखा माना जाता है .
   
   एफ ₁ सेंट पर: नोटउम्र वहाँ कई ट्रांसजेनिक जानवर हो सकता है, लेकिन हो सकता है वे स्थिर नहीं कर रहे हैं. एफ ₁ ट्रांसजेनिक जानवर के बहुमत एफ ₂ स्थिर लाइनों में प्रचार नहीं करेंगे.
   
   नोट: जीन की नकल संख्या में परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रण करने के लिए, तीन इंजेक्शन का निर्माण प्रति स्वतंत्र स्थिर लाइनों की एक न्यूनतम उत्पन्न.
   
   
4. प्रत्येक स्वतंत्र स्थिर लाइन कीड़े की एक अलग लाइन के रूप में रखा जाना चाहिए. प्रत्येक पंक्ति हर पीढ़ी में एक नया प्लेट कई ट्रांसजेनिक जानवर स्थानांतरित द्वारा प्रचारित किया जा सकता है, यह एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाना चाहिए अगर चयन मार्कर फ्लोरोसेंट है.

Discussion

जब इस प्रक्रिया कर रही है, यह महत्वपूर्ण है को याद है:
- जननपिंड के केंद्र में सीधे इंजेक्षन
- बहुत ज्यादा तरल नहीं इंजेक्षन
- जल्दी काम करने के लिए dessication को रोकने.

यदि आप सुई, इस तरह के रूप में यह बहुत बड़ी टूट गया है के साथ समस्याओं में चलाने के लिए, यह सबसे अच्छा है आदर्श सुई की तुलना में एक कम समय के साथ इंजेक्षन करने की कोशिश के बजाय एक ताजा सुई रीमेक है.

ट्रांसजेनिक कीड़े की पीढ़ी इस तरह के रूप में कई आवेदन किया है:
उत्परिवर्ती जीन की पहचान, विधि में परिवर्तन बचाव बुलाया
- प्रोटीन डोमेन के छोटा प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से मैपिंग
सेलुलर और रोग प्रक्रियाओं में एक जीन की भूमिका के लक्षण वर्णन.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef	Hulle 10S	elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm		Fisher Scientific	12-548-A
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Coverglass 22x50 mm		Fisher Scientific	12-545-E
100 ul Capillary		VWR international	53432-921
Glass Capillary for Needles	"Kwik-Fil"	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Needle Puller	Tool	Narishige International	Model PP-830
microINJECTOR System		Tritech Research, Inc.	MINJ-1000	Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645