Summary
Denna video visar den teknik för mikroinjektion i gonad av C. elegans för att skapa transgena djur.
Abstract
Transgena Caenorhabditis elegans lätt kan skapas via mikroinjektion av en DNA-plasmid lösningen i gonad 1. Den plasmid-DNA ordnar för att bilda extrakromosomala concatamers som stabilt ärvs, men inte med samma effektivitet som den faktiska kromosomer 2. En gen av intresse är samarbetet injiceras med en uppenbar fenotypisk markör, som rol-6 eller GFP, för att möjliggöra val av transgena djur under en dissekera mikroskop. Den exogena gen kan uttryckas från sin ursprungliga promotor för cellulär lokalisering studier. Alternativt kan transgenen drivas av en annan vävnad-specifika promotorn för att bedöma den roll som genen produkten i just den cell eller vävnad. Denna teknik driver effektivt genuttryck i alla vävnader hos C. elegans förutom könsceller eller tidiga embryot 3. Skapande av transgena djur är allmänt används för en rad experimentella paradigm. Denna video visar mikroinjektion proceduren för att skapa transgena maskar. Dessutom är urvalet och upprätthållande av stabila transgena C. elegans riktlinjer som beskrivs.
Protocol
Expression Plasmid Konstruktion
Två plasmider behövs: en för vävnadsspecifika uttryck av genen av intresse och en andra som valbar omvandling markör.
Experimentell Plasmid
- Välj en promotor som uttrycks i vävnaden / cellen typ av intresse, exempelvis en nerv eller muskel-specifika promotorn. Om man skall uttrycka flera gener i samma vävnad, kan en projektansvarig kassett plasmid i Gateway-systemet (Invitrogen) användas. Detta tillvägagångssätt gör införandet av varje gen av intresse nedströms arrangören av Rekombination kloning 4. Generellt är 2-5 kb uppströms sekvenser tillräckligt för att få korrekt och exakt uttryck.
- Den cDNA av genen av intresse kan klonas på två sätt:
- Konventionella kloning med restriktionsenzymer.
- För Gateway kloning är det PCR amplifieras med primers som innehåller Gateway Att B Rekombination sekvens. Den förstärkta cDNA är först rekombinerat in givaren vektor pDONR201 att skapa posten vektor och sedan omvandlas till E. coli stam DH5a. Efter urval av framgångsrika rekombinanter och mini-prep isolering av DNA, en post vektorn rekombinerat i promotor som innehåller destination vektor för att skapa uttrycket plasmiden. Detaljer om Rekombination kloning är tillgängliga från antingen Invitrogen Gateway manuellt eller i Caldwell et al. 5.
Markör Plasmid
Exempel på transgena markör plasmider inkluderar rol-6 eller användning av kroppen väggen muskler promotor UNC-54 för att driva fluorescerande protein uttryck. Dessa markörer plasmider är vanligtvis tillgängliga från inom forskarsamhället på begäran.
Mikroinjektion av C. elegans
Förberedelser
- DNA-isolering av de två plasmider som ska injiceras. Kvantifiera dem och blanda ihop i en 1:1 ratio på 50 ng / l vardera.
- Förbered agar bromsklossar:
- Gör en 2% agaroslösningen i vatten, värme eller mikrovågsugn tills det är upplöst.
- Ställ ut flera 22 x 50 glas mm locket på en bänk.
- Med hjälp av en pasteurpipett, placera en droppe av smält agarosen på ett skyddsglas och omedelbart placera en andra skyddsglas över droppe i 90 vinkel mot den första. Upprepa för flera andra täckglas. Diametern på platta skiva av agaros bör vara mellan 15-20 mm.
- När agarosen stelnat (det tar bara minuter), ta bort locket glas och låt pad lufttorka helt (flera timmar eller över natten).
- Förvara dynor i ett skyddsglas låda vid rumstemperatur.
- Gör nål lastare för DNA-lösning:
Nål lastare skapas från 100 l kapillärrör som värms i mitten över en öppen eld och snabbt dras att cirka två gånger sin längd. De två halvorna snäpps isär när kapillärröret svalnar. Stockpile 10-20 nål lastare för injektion. Förvara upprätt i en mikrocentrifugrör rack. Var försiktig så att inte spetsa sig på poäng. - Gör mikroinjektion nålar:
Nålen är tillverkad av en speciell kapillärrör som innehåller en intern glasfiber, detta glödtråden fungerar som en veke för DNA-lösningen. Dessa drog på en nål-avdragare maskin. Vi använder en Narishige PP-830 avdragare med ett värmeläge på 24,8. Flera nålar dras i taget och lagras i en liten plastlåda. Flera nålar kan lätt "monteras" på en remsa av modellera för långsiktig lagring. - Nålspetsen "brytare":
Spetsen på mikroinjektion nålen dras så fin att det faktiskt är stängt på det slut och bör delas öppet med hjälp av små skärvor av skyddsglas. Dessa förbereds genom att linda en 18 x 18 glas mm täcka i en pappershandduk och försiktigt tryck tills det går sönder i flera bitar. Skärvor av en bra storlek är cirka 3 x 4 mm. - Växer vild typ (N2) maskar till den tidiga vuxna scenen för injektion med standardförfaranden 6. Förbered cirka 100 iscensatt ordentligt maskar / konstruera injiceras.
Förfarande
- Öppna huvudventilen på en helium tank som är ansluten till en mikroinjektion nål arm och hållare. Stäng regulatorventil att låta gasen att komma in på linjen, vilket innebär att trycket till 35 psi. Observera att gas kan frigöras med hjälp av en fotpedal.
- Sätt en nål lastare en standard mun pipetter slang (finns i behållare av glas kapillärrör) och upprätta en liten del av plasmiden blandning (~ 1 l).
- Nålen lastaren är noga placeras i den bakre änden av en injektionsnål och försiktigt in hela vägen genom längdennålen tills ett motstånd känns. Utvisa den DNA-lösningen genom att försiktigt blåsa, ta sedan bort lastaren.
- Sätt in nålen i mikroinjektion armen, är noga med att placera den i de små interna gummipackning.
- Sätt en nål-breaking skärvan av täckning glas på ena kanten av ett agar pad. Täck skärvan, liksom hela ytan av agar pad, med Halocarbon olja. Placera agar plattan på scenen av ett inverterat mikroskop.
- Placera nålen i mitten av synfält med 4X mål och ljusa fält belysning, men som ännu inte sänka den i oljan. Dessutom, placera innerkanten av skärvan av täckglaset i centrum, sedan fokusera på det (fortfarande använder 4X mål). Sänk nålen i olja, föra den in i samma fokalplanet som skärvan av täckning glas. Höj förstoringen genom att byta till 40X målet. Åter fokusera på kanten av skärvan och flytta nålspetsen, om det behövs.
- Att öppna upp toppen på injektionsnålen försiktigt knuffa nålen mot kanten av locket glas skärvan, men samtidigt tillämpa en kort puls av gas via fotpedalen. Nålen kommer att vara tillräckligt bryts öppen när små droppar av vätska försvinna i slutet av nålen. Överflödig vätska flöde på grund av för stor öppning är inte önskvärt, eftersom det kommer att döda djuren.
- Ta bort agar pad från scenen genom att höja nålen upp, men ändrar inte X-eller Y-axeln position. Skjut scenen ut underifrån nålen, avlägsna agar plattan och placera den på en dissekera mikroskop. Överför en mask på plattan, under ytan av oljan. Om masken slingrar sig försiktigt stroke den tills den kommer i kontakt med agar plattan. Den fuktiga masken bör följa den torra agaros.
- Injektion
- Placera snabbt tillbaka agar plattan på scenen, centrering masken i synfältet.
- Sänk nålen i samma plan i fokus som masken.
- Växla filter för att Hoffman Illumination (en typ av kontrast filter). Detta gör morfologisk detalj av masken för att bli synliga. Om Nomarski / DIC optik finns på den inverterade omfattning som kommer att fungera lika bra. Använda 40X mål, fokusera på "grynig" syncytial mitten av masken gonad, under "honeycomb" mönster av grodden atomkärnor (välj vilket som gonad är placerad på sidan av masken mot nålen).
- Finjustera positionen av nålen tills spetsen är också i fokus (samma plan som gonad "kornighet").
- Försiktigt in nålen i mitten av gonad och tillämpa en kort puls av gastryck att utvisa en droppe eller två av DNA i gonad armen. Du bör observera en våg av vätska spridda över distala gonad. Förutsätt inte mer vätska är bättre, eftersom för mycket vätska kan strömma in i proximala krök av gonad arm, som kan stänga av äggcellen produktion. Om möjligt, beroende på positionen av masken, injicera den andra gonad armen på samma sätt.
- Det är viktigt att arbeta snabbt samtidigt som injicerar en mask, eftersom det lätt kan uttorka. Beslutet att injicera den andra gonad armen är beroende på hur snabbt du kan placera om nålen och masken. Hela processen ska helst ta mindre än 1-2 minuter.
- Ta bort locket glas från scenen och placera den på en dissekera omfattning. Applicera 1μl av M9-buffert (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1mm MgSO 4) direkt på den injicerade masken (detta kan innebära att dränka pipettspetsen under ytan av Halocarbon olja). Bufferten bör rehydrera masken, kommer det då flyta bort agarosen pad yta. Överför masken till en vanlig tallrik med hjälp av en mask plocka. Den agarosen pad kan återanvändas flera gånger tills det har blivit alltför mättad med buffert och maskarna inte längre hålla sig.
Transgena val
- Injiceras maskar, P 0 generationen, överförs till enskilda färska, bacterially seedade plattor (60 mm) och får möjlighet att föröka sig. Normalt injiceras djur inkuberas vid 20 ° C i 2-3 dagar tills avkomman visas.
- F 1-avkomman observeras efter spår av transgena markör (t.ex. fluorescens) med hjälp av en fluorescerande stereomikroskop. Varje lysrör, bärare F 1 är djur separat klonade på en ny platta (eftersom avkommorna från varje F 1 anses vara en distinkt linje). F 1 hermafroditer tillåts föröka sig. Återigen, detta är normalt utförs vid 20 ° C i 2-3 dagar tills avkomman visas.
- F 2 generationen observeras för transgena djur också. F 2 djur som har ärvt och uttrycka transgena mängd anses vara en "stabil" linje.
OBS: Vid F 1: aålder kan det finnas många transgena djur, men de är inte stabila. Majoriteten av F 1 transgena djur kommer inte att propageras till F 2 stabila linjer.
OBS: För att kontrollera för variationer i antal genkopior, generera minst tre oberoende stabila linjer per injiceras konstruktion. - Varje oberoende stabil linje bör behållas som en separat rad med maskar. Varje linje kan förökas genom att överföra flera transgena djur till en ny platta vid varje generation, detta måste utföras med hjälp av en fluorescerande stereomikroskop om markör är fluorescerande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När du gör detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att:
- Injicera direkt i mitten av gonad
- Inte injicerat för mycket vätska
- Arbeta snabbt för att förhindra uttorkning.
Om du stöter på problem med nålen som det bryts för stor, är det bäst att göra om en ny nål, snarare än att försöka att injicera med en mindre än idealisk nål.
Den generation av transgena maskarna har många applikationer såsom:
- Identifiering av muterade gener, i metod som kallas transformation räddning
- Kartläggning av protein domäner genom uttryck av stympad proteiner
- Karakterisering av rollen av en gen i cell-och sjukdomsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill erkänna den kooperativa andan i alla Caldwell Lab medlemmar. Rörelsestörningar forskning i labbet har fått stöd från Bachmann-Strauss dystoni och Parkinsons Foundation, Förenade Parkinsons Foundation, American Parkinsons sjukdom Association, Parkinsons sjukdom Association of Alabama, Michael J. Fox Foundation for Parkinson forskning, och en Grundutbildning forskning.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18x18 mm | Fisher Scientific | 12-548-A | ||
| Coverglass 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22x50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR international | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | "Kwik-Fil" | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige International | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research, Inc. | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 |
References
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
