Summary
Dieses Video zeigt die Technik der Mikroinjektion in die Gonade von C. elegans, um transgene Tiere zu schaffen.
Abstract
Transgene Caenorhabditis elegans leicht über Mikroinjektion eines DNA-Plasmid-Lösung in die Gonade 1 erstellt werden. Die Plasmid-DNA lagert sich extrachromosomale Konkatamere, die stabil vererbt werden, wenn auch nicht mit der gleichen Effizienz wie tatsächliche Chromosomen 2 zu bilden. Ein Gen von Interesse ist mit einer offensichtlichen phänotypischen Marker, wie rol-6 oder GFP co-injiziert, um die Auswahl von transgenen Tieren unter einem Binokular erlauben. Das exogene Gen kann aus seiner nativen Promotor für zelluläre Lokalisation Studien ausgedrückt werden. Alternativ kann das Transgen von einem anderen Gewebe-spezifischen Promotor, um die Rolle des Genprodukts in der jeweiligen Zelle oder eines Gewebes zu beurteilen gefahren werden. Diese Technik effizient Laufwerke Genexpression in allen Geweben von C. elegans mit Ausnahme der Keimbahn oder frühen Embryo 3. Erstellung von transgenen Tieren ist bekannt für eine Reihe von experimentellen Paradigmen genutzt. Dieses Video zeigt die Mikroinjektion Verfahren zur transgenen Würmern zu generieren. Darüber hinaus ist die Auswahl und Pflege von stabilen transgenen C. elegans Zeilen beschrieben.
Protocol
Expressionsplasmid Construction
Zwei Plasmide sind erforderlich: eine für Gewebe-spezifische Expression des Gens von Interesse und eine zweite als wählbare Transformation Marker.
Experimentelle Plasmid
- Wählen Sie einen Promotor, der in dem Gewebe / Zelltyp von Interesse, zum Beispiel, einen Nerv oder Muskel-spezifischen Promotors exprimiert wird. Wenn man mehrere Gene im gleichen Gewebe auszudrücken ist, kann ein Promotorkassette Plasmid in das Gateway-System (Invitrogen) verwendet werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Einfügung von jedem Gen von Interesse stromabwärts des Promotors durch recombinational Klonen 4. Generell ist 2-5 kb Upstream-Sequenzen aus, um korrekte und genaue Ausdruck haben.
- Die cDNA des Gens von Interesse kann auf zwei Arten geklont werden:
- Konventionelle Klonen mit Hilfe von Restriktionsenzymen.
- Für Gateway-Klonen ist es PCR mit den Primern, dass das Gateway att B recombinational Sequenz enthalten. Die amplifizierte cDNA wird zunächst in der Donor-Vektor pDONR201 um den Eintrag zu erstellen Vektor rekombiniert und dann in E. coli-Stamm DH5a. Nach der Auswahl von erfolgreichen Rekombinanten und mini-prep Isolierung von DNA, wird der Eintrag Vektor in die Promotor-Destination-Vektor zu erstellen Expressionsplasmid rekombiniert. Details zu recombinational Klonen sind entweder von der Invitrogen Gateway-Handbuch oder in Caldwell et al Verfügung. 5.
Selektionsmarker Plasmid
Als Beispiele transgener Marker Plasmide umfassen rol-6 oder Gebrauch des Körpers Wand Muskel Promoter unc-54 um fluoreszierende Protein-Expression zu fahren. Diese Marker Plasmide sind in der Regel innerhalb der Forschergemeinde auf Anfrage zur Verfügung.
Mikroinjektion von C. elegans
Vorbereitung
- Führen DNA-Isolierung der beiden Plasmide, die injiziert werden sollen. Quantifizieren sie und mischen im Verhältnis 1:1 von 50 ng / ul jeder.
- Bereiten Sie Agar-Pads:
- Machen Sie einen 2% igen Lösung in Wasser, Wärme oder in der Mikrowelle bis zur Lösung.
- Set aus mehreren 22 x 50 mm Deckgläser auf einem Labortisch.
- Mit einer Pasteurpipette einen Tropfen des geschmolzenen Agarose auf einem Deckglas und sofort Platz ein zweites Deckglas über die Tropfen in einem 90-Winkel zur ersten. Wiederholen Sie dies für einige andere Deckgläser. Der Durchmesser des abgeflachten Scheibe aus Agarose sollte zwischen 15-20 mm sein.
- Nach Erstarren der Agarose (dies dauert nur Momente), entfernen Sie die Abdeckung aus Glas und lassen Sie das Pad an der Luft trocknen komplett (mehrere Stunden bis über Nacht).
- Bewahren Sie die Pads in einem Deckglas Feld bei Raumtemperatur.
- Machen Nadel Lader für DNA-Lösung:
Needle Lader sind aus 100 ul Kapillaren, die in der Mitte über einer offenen Flamme erhitzt und schnell auf etwa das Doppelte ihrer Länge gezogen geschaffen. Die beiden Hälften sind getrennt, sobald die Kapillare kühlt aufgeschnappt. Stockpile 10-20 Nadel Lader zur Injektion. Aufrecht lagern in einem Mikrozentrifugenröhrchen Rack. Seien Sie vorsichtig, um nicht aufspießen sich auf die Punkte. - Machen Mikroinjektion Nadeln:
Die Nadel ist aus einem speziellen Kapillarröhrchen, dass eine interne Glasfilament enthält gemacht, das Filament dient als Docht für die DNA-Lösung. Diese basieren auf einer Nadel-Abzieher Maschine gezogen. Wir verwenden eine Narishige PP-830 Abzieher mit einer Heizstufe von 24,8. Mehrere Nadeln sind in einer Zeit gezogen und in einem kleinen Plastik-Box gespeichert. Mehrere Nadeln können leicht "gemountet" werden auf einem Streifen Knetmasse für eine langfristige Lagerung. - Nadelspitze "Brandung":
Die Spitze des Mikroinjektionsnadel gezogen wird so fein, dass es tatsächlich daran geschlossenen Ende und sollte aufgebrochen werden mit kleinen Scherben Deckglas. Diese werden durch das Einwickeln eines 18 x 18 mm Deckglas in ein Papiertuch und sanft Druck, bis es in mehrere Teile zerbricht vorbereitet. Scherben eines nützliche Größe ca. 3 x 4 mm. - Wachsen Wildtyp (N2) Würmer bis in die frühen Erwachsenen-Stadium für die Injektion mit Standard-Verfahren 6. Bereiten Sie etwa 100 richtig inszeniert Würmer / Konstrukt injiziert.
Verfahren
- Öffnen Sie das Ventil auf ein Helium-Tank, die zu einem Mikroinjektionsnadel Arm und Halter verbunden ist. Schließen Sie das Regelventil, damit das Gas in die Zeile eingeben, wodurch der Druck auf 35 psi. Beachten Sie, dass das freigesetzte Gas kann mit einem Fußpedal werden.
- Legen Sie eine Nadel-Loader in einen Standard-Mund Pipette Schlauch (gefunden in Behältnissen aus Glas Kapillaren) und stellt eine kleine Menge der Plasmid-Mischung (~ 1 ul).
- Die Nadel-Loader wird vorsichtig in das hintere Ende einer Injektionsnadel gesetzt und sanft eingesetzt ganzen Weg durch die Länge derdie Nadel bis Widerstand zu spüren. Vertreibt die DNA-Lösung durch leichtes Blasen, entfernen Sie dann mit dem Kran.
- Legen Sie die Nadel in den Arm Mikroinjektion, wobei darauf geachtet, um es im kleinen internen Gummidichtung Platz.
- Legen Sie eine Nadel-breaking Splitter Deckglas an einer Kante einer Agar-Pad. Bedecken Sie den Splitter, sowie die gesamte Oberfläche des Agar-Pad, mit Halocarbonöl. Legen Sie die Agar-Pad auf der Stufe eines inversen Mikroskops.
- Position der Nadel in der Mitte des Gesichtsfeldes mit dem 4X objektive und Hellfeldbeleuchtung, aber noch nicht unten in das Öl. Auch, stellen Sie den inneren Rand der Scherbe Deckglas in der Mitte, dann auf ihn zu konzentrieren (immer noch mit 4X Ziel). Senken Sie die Nadel in das Öl, womit sie in der gleichen Bildebene als Splitter Deckglas. Erhöhen Sie die Vergrößerung durch die Umstellung auf den 40X-Objektiv. Neuausrichtung auf den Rand der Scherbe und Neupositionierung der Spitze der Nadel, wenn nötig.
- Zum Öffnen der Spitze der Injektionsnadel, sanft anstoßen die Nadel gegen die Kante der Abdeckung Glasscherbe, während zur gleichen Zeit die Anwendung einen kurzen Impuls von Gas über das Fußpedal. Die Nadel wird ausreichend gebrochen werden geöffnet, wenn kleine Tröpfchen von Flüssigkeit austreten Ende der Nadel. Überschüssige Flüssigkeit fließen durch eine zu große Öffnung ist nicht wünschenswert, da es die Tiere zu töten.
- Entfernen Sie die Agar-Pad von der Bühne durch eine Erhöhung der Nadel nach oben, aber keine Änderung der X-oder Y-Achsen-Position. Schieben Sie die Bühne nicht unterhalb der Nadel, entfernen Sie die Agar-Pad und platzieren es auf einem Binokular. Transfer ein Wurm auf dem Pad, unter der Oberfläche des Öls. Wenn der Wurm schlängelt sich sanft streicheln, bis sie die Agar-Pad. Die feuchte Wurm sollte auf die trockene Agarose halten.
- Injektion
- Raschen Platzierung der Agar-Pad zurück auf die Bühne, Zentrierung der Wurm in das Blickfeld.
- Senken Sie die Nadel in der gleichen Ebene des Fokus wie der Wurm.
- Schalten Sie den Filter auf Hoffman Illumination (eine Art von Gegensatz Filter). Dies ermöglicht morphologische Details des Wurms sichtbar werden. Wenn Nomarski / DIC-Optik sind auf den invertierten Bereich, der so gut funktionieren wird. Mit dem 40X-Objektiv, über die "körnige" Syncytial Zentrum der Wurm Gonade, unterhalb der "Wabe"-Muster des Keims Kerne (wählen Sie je nachdem, was Gonade befindet sich auf der Seite der Wurm vor der Nadel positioniert) zu konzentrieren.
- Feinabstimmung der Position der Nadel, bis die Spitze auch im Fokus (der gleichen Ebene wie die Gonade "Körnigkeit").
- Schieben Sie die Nadel in der Mitte der Gonade und wenden Sie einen kurzen Puls der Gasdruck auf einen Tropfen oder zwei von DNA in die Gonaden Arm zu vertreiben. Sie sollten eine Welle der Flüssigkeit verteilt über den distalen Gonaden zu beobachten. Gehen Sie nicht davon mehr flüssig ist besser, da zu viel Flüssigkeit in den proximalen Kurve der Gonade Arm, der heruntergefahren werden Eizelle Produktion fließen kann. Wenn möglich, abhängig von der Position des Wurms, spritzen sie den anderen Gonade Arm in der gleichen Weise.
- Es ist wichtig, schnell zu arbeiten während der Injektion ein Wurm, da sie leicht austrocknen. Die Entscheidung für die zweite Gonade Arm spritzen ist abhängig, wie schnell man wieder Position der Nadel und Wurm. Der gesamte Prozess sollte idealerweise weniger als 1-2 Minuten.
- Entfernen Sie die Abdeckung aus Glas von der Bühne und legen Sie es auf einem Binokular. Bewerben 1μl der M9-Puffer (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO 4) direkt auf das injizierte Wurm (dies könnte zur Folge Eintauchen der Pipettenspitze unter der Oberfläche des Halocarbonöl). Der Puffer sollte rehydrieren der Wurm, es wird dann float aus dem Agarose-Pad-Oberfläche. Übertragung der Wurm zu einer regelmäßigen Platte mit einem Wurm zu pflücken. Die Agarose-Pad kann mehrere Male wiederverwendet werden, bis es geworden ist, zu gesättigt mit Puffer und die Würmer nicht mehr zu halten.
Transgene Auswahl
- Injected Würmer, die P 0 Generation, sind auf die individuellen frisch, bakteriell ausgesät Platten (60 mm) überführt und zu reproduzieren. Typischerweise sind injizierten Tieren bei 20 ° C für 2-3 Tage inkubiert, bis die Nachkommen erscheinen.
- Die F 1 Nachkommen sind zum Nachweis der transgenen Marker (z. B. Fluoreszenz) mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskop beobachtet. Jeder fluoreszierend, Träger F 1, ist Tier einzeln auf eine neue Platte geklont (seit Nachkommen von jedem F 1 eine klare Linie berücksichtigt werden). Die F 1 Hermaphroditen sind erlaubt sich zu vermehren. Auch dies ist in der Regel bei 20 ° C für 2-3 Tage durchgeführt, bis die Nachkommen erscheinen.
- Die F 2-Generation ist für transgene Tiere sowie beobachtet. F 2 Tiere, die geerbt haben und drücken die transgenen Array werden als "stable"-Zeile.
HINWEIS: Bei der F 1 stAlter kann es viele transgene Tiere, aber sie sind nicht stabil. Die Mehrzahl der F 1 transgenen Tieren nicht in F 2 stabile Linien vermehrt werden.
HINWEIS: Für die Steuerung für die Variabilität in der Genkopienzahl, erzeugen ein Minimum von drei unabhängigen stabilen Linien pro Konstrukt injiziert. - Jeder unabhängige stabile Linie sollte in einer separaten Zeile der Würmer gehalten werden. Jede Zeile kann durch die Übertragung von mehreren transgenen Tieren, um eine neue Platte bei jeder Generation weitergegeben werden, dies muss mit Hilfe eines fluoreszierenden Stereomikroskop werden, wenn der Selektionsmarker ist fluoreszierend.
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Discussion
Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, um:
- Einfügen direkt in das Zentrum der Gonade
- Nicht spritzen zu viel Flüssigkeit
- Schnell zu arbeiten, um Austrocknung zu verhindern.
Wenn Sie Probleme mit der Nadel, wie es gebrochen ist zu groß ausgeführt wird, ist es am besten Remake eine frische Nadel, anstatt zu versuchen, mit einem weniger als ideal Nadel injiziert.
Die Erzeugung von transgenen Würmer hat viele Anwendungen wie zum Beispiel:
- Identifizierung von mutierten Genen, in Methode aufgerufen Transformation Rettung
- Abbildung von Protein-Domänen durch die Expression des verkürzten Proteinen
- Charakterisierung der Rolle eines Gens in Zellen und Krankheitsprozesse.
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Acknowledgments
Wir wollen den Geist der Zusammenarbeit aller Caldwell Lab Mitglieder anzuerkennen. Bewegungsstörungen Forschung im Labor wurde von der Bachmann-Strauss Dystonie & Parkinson Foundation, Vereinigte Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Parkinson Disease Association of Alabama, die Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research, und ein Undergraduate Research unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18x18 mm | Fisher Scientific | 12-548-A | ||
| Coverglass 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22x50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR international | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | "Kwik-Fil" | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige International | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research, Inc. | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 |
References
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
