Summary
Bu video transgenik hayvanlar oluşturmak için C. elegans gonad içine mikroenjeksiyon tekniği göstermektedir.
Abstract
Transgenik Caenorhabditis elegans gonad 1 DNA plazmid çözüm mikroenjeksiyon ile kolayca oluşturulabilir. Plazmid DNA, stabil bir şekilde olsa da gerçek kromozom 2 olarak aynı verimlilikle değil, miras alınır ekstrakromozomal concatamers oluşturmak için yeniden düzenler . Diseksiyon mikroskobu altında transgenik hayvanlar seçimi izin vermek, ilgi bir gen rol-6 ya da GFP gibi bariz bir fenotipik işaretleyici ile ortak enjekte edilir. Eksojen gen hücresel yerelleştirme çalışmaları için ana organizatörü ifade edilebilir. Alternatif olarak, transgen, bu belirli bir hücre ya da doku gen ürünü rolünü değerlendirmek için farklı bir doku-spesifik organizatörü tarafından sürülebilir. Bu teknikte verimli C. elegans germline ya da erken embriyo 3 hariç bütün dokularda gen ekspresyonu sürücüler. Transgenik hayvanlar oluşturulması, deneysel paradigmalar bir dizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu video transgenik solucanları oluşturmak için mikroenjeksiyon işlemi göstermektedir. Ayrıca, istikrarlı transgenik C. elegans hatları seçimi ve bakım açıklanmıştır.
Protocol
İfade Plazmid yapı
İki plazmid gereklidir: doku özel ilgi gen ekspresyonu ve seçilebilir dönüşüm belirteci olarak ikinci bir biri.
Deneysel Plazmid
- Örneğin faiz doku / hücre tipi, bir sinir ya da kas-özel organizatörü olarak ifade organizatörü seçin. Aynı doku içinde birden fazla genin ifade etmek için ise, Gateway sisteminin (Invitrogen) plazmid bir yararlanıcı kaset kullanılabilir. Bu yaklaşım, recombinational klonlama 4 organizatörü faiz downstream herhangi bir gen ekleme sağlar. Genellikle 2-5 kb upstream dizilerinin doğru ve doğru ifade etmek için yeterli.
- CDNA ilgi genin iki şekilde klonlanmış olabilir:
- Restriksiyon enzimlerini kullanarak Konvansiyonel klonlama.
- Gateway klonlama için, PCR Ağ Geçidi att B recombinational dizisi içeren primerler kullanılarak amplifiye. Amplifiye cDNA ilk giriş vektörü oluşturmak için donör vektör pDONR201 recombined ve sonra E. dönüştü coli suşu DH5a. Başarılı rekombinantlar ve DNA mini hazırlık izolasyon seçimi takiben, giriş vektörü ifade plazmid yaratmak için organizatörü içeren hedef vektör recombined. Recombinational klonlama Ayrıntılar Invitrogen Ağ Geçidi manuel veya Caldwell ve ark mevcuttur. 5.
Plazmid Seçilebilir Marker
Transgenik işaret plazmid örnekleri, rol-6 ya da vücut duvarı kas organizatörü unc-54 floresan protein ekspresyonu sürücü kullanımı sayılabilir. Bu işaretleyici plazmidler genellikle istek üzerine araştırma toplum içinde mevcuttur.
C. elegans, Mikroenjeksiyon
Hazırlık
- Enjekte edilecek olan iki plazmid DNA izolasyonu gerçekleştirin. Asitli ve 50 ng / ul her 1:1 oranında karıştırın.
- Agar pedleri hazırlayın:
- Eriyene kadar ısı veya mikrodalga% 2 agaroz su çözümü olun.
- Bir masa üstü birkaç 22 x 50 mm kapak camları yola çıktı.
- Pasteur pipeti kullanarak, bir kapak cam erimiş agaroz bir damla koyun ve hemen ilk 90 açıyla açılan üzerinden ikinci bir cam kapak yerleştirin. Diğer birçok kapak camları için bu işlemi tekrarlayın. Agaroz basık disk çapı 15-20 mm arasında olmalıdır.
- Agaroz (Bu dakikanızı alır) katılaşmış sonra, kapak camını çıkarın ve pedi tamamen kurumaya izin (bir gecede birkaç saat).
- Cam bir kapakla kutusunda yastıkları, oda sıcaklığında saklayın.
- DNA çözümü için iğne yükleyiciler olun:
İğne yükleyiciler ortasında açık ateşte ısıtılır ve boyları yaklaşık iki katı hızla çekti 100 ul kılcal tüpler oluşturulur. Kılcal tüp soğutulduktan sonra iki yarısı ayrı tersledi. 10-20 enjeksiyon için iğne yükleyiciler Stoğu. Dik bir mikrosantrifüj tüp rafta saklayın. Noktalarda kendini Impale olarak dikkatli kullanın. - Mikroenjeksiyon iğne yapın:
Bir iç cam elyaf içeren özel bir kılcal tüpten iğne yapılır; bu filament DNA çözümü için bir fitil olarak hizmet vermektedir. Bu iğne çektirmenin makinede çekilir. Biz bir ısı ayarı ile 24.8 Narishige PP-830 çektirmesi kullanın. Bir seferde birkaç iğne çekilir ve küçük bir plastik kutu içinde saklanır. Birden fazla iğne kolayca modelleme kil, uzun süreli depolama için bir şerit üzerinde "monte" olabilir. - İğne ucu "kesiciler"
Mikroenjeksiyon iğne ucu kadar ince aslında sonu kapalı olduğunu çekilir ve küçük kapak cam kırıkları ile açık kırık olmalıdır. Bu bir kağıt havlu, 18 x 18 mm kapak cam ambalaj ve birkaç parçaya kırar kadar hafifçe basınç uygulayarak tarafından hazırlanır. Shard yararlı bir boyutu yaklaşık 3 x 4 mm. - Vahşi tip (N2) solucanlar standart prosedürler kullanarak 6 enjeksiyon için erken yetişkinlik evresi için büyütün. Yaklaşık 100 hazırlayın düzgün solucanlar sahnelenen / inşa enjekte.
Prosedür
- Mikroenjeksiyon iğne kol ve sahibine bağlı olan bir helyum tankı ana vanayı açın. Gaz basıncı 35 psi getirerek, çizgi girmek için izin vermek için regülatör vanasını kapatın. Ayak pedalı ile gaz açığa çıkabilir dikkat edin.
- Bir iğne yükleyici, standart bir ağız pipetter cam kapiller tüplerin kaplar içinde bulunan tüp içine yerleştirin ve plazmid karışımı (~ 1 ul) küçük bir miktar yukarı çekmek.
- Iğne yükleyici bir enjeksiyon iğnesi arka uç dikkatlice yerleştirilir ve hafifçe uzunluğu boyunca tüm yol takılıiğne kadar direnç hissedilir. Hafifçe üfleyerek DNA çözüm kovduktan sonra yükleyici çıkarın.
- Küçük kauçuk conta içinde yerleştirmek için dikkatli olmak, mikroenjeksiyon koluna iğne takın.
- Agar bir ped bir kenarı cam kapak iğne kırma shard yerleştirin. Halokarbon yağ ile, shard, agar pad gibi tüm yüzeyi örtün. Ters bir mikroskop sahnede agar yastık yerleştirin.
- 4X objektif ve parlak bir alan aydınlatma kullanarak görüş alanının merkezinde iğne pozisyonu, ama henüz yağa düşürmez. Ayrıca, merkezde kapak cam shard iç kenarı konumu, o zaman odaklanmak (hala 4X objektif kullanarak). Cam kapak shard aynı odak düzlem haline getirerek, yağ içine iğne indirin. 40X objektif geçiş büyütme kaldırın. Shard kenarı üzerinde odaklanılması ve gerekirse iğne ucu yeniden konumlandırmak.
- Ayak pedalı ile gaz kısa bir darbe uygulayarak, aynı zamanda da bir iğne ucu kadar açmak için, yavaşça, kapak cam Shard kenarına iğne dürtmek. Sıvı küçük damlacıklar iğne sonunda kaçmak iğne yeterince açık kırılmış olacaktır. Hayvanları öldürecek gibi çok büyük bir açılış nedeniyle Aşırı sıvı akış, arzu edilen değildir.
- Iğne kadar yükselterek aşamasından agar pedini, ancak X ya da Y ekseni konumunu değiştirmez. Aşamada iğnenin altından dışarı doğru kaydırın, agar pad kaldırmak ve diseksiyon mikroskobu üzerine yerleştirin. Petrol yüzeyinin altında bir solucan, ped üzerine aktarın. Eğer solucan wriggles, yavaşça felç temas agar pad kadar. Nemli solucan kuru agaroz uymalıdır.
- Enjeksiyon
- Hızla, sahneye agar pad yerine geri görüş alanı solucan merkezleme.
- Solucan gibi odak aynı düzlem içine iğne indirin.
- Hoffman Işık (kontrast filtre türü) filtreleri geçin. Bu solucanın morfolojik ayrıntı görünür olmasını sağlar. Nomarski / DIC optik ters kapsamı üzerinde de çalışacak. 40X objektif kullanarak, mikrop çekirdeğinin "petek" desen altında solucan gonad "grenli" sinsityal merkezi, (solucan iğne bakan tarafında konumlandırılmış hangisi gonad seçin) odaklanmak.
- İnce ayar iğne ucu (gonad "grenleşme" olarak aynı düzlemde) odak kadar pozisyonu.
- Gonad merkezi haline hafifçe iğne takın ve DNA ile ilgili bir ya da iki damlacık gonad kol sınırdışı gaz basıncı kısa bir darbe uygulayın. Distal gonad boyunca sıvı yayılmış bir dalga dikkat etmelisiniz. Oosit üretim kapatabilirsiniz gonad kol proksimal viraj içine çok fazla sıvı akabilir yılından bu yana daha fazla sıvı, daha iyi kabul etmeyin. Eğer mümkünse, solucanın pozisyonuna bağlı olarak, aynı şekilde diğer gonad kol enjekte edilir.
- Kolaylıkla birbirinden ayrılacak gibi, bir solucan enjekte ederken hızlı çalışması için önemlidir. Ikinci gonad kol enjekte kararı iğne ve solucan yeniden pozisyonu ne kadar hızlı bağlıdır. Tüm süreci, ideal olarak 1-2 dakika daha az almalıdır.
- Aşamasından cam kapak çıkarın ve diseksiyon kapsamı üzerine yerleştirin. Doğrudan enjekte solucan üzerine M9 tampon 1μl (22mm KH 2 PO 4, 42mm, Na 2 HPO 4, 85mm NaCl, 1mm MgSO 4) (Bu Halokarbon petrol yüzeyinin altında pipet daldırarak yol açabilir) uygulayın. Tampon solucan rehidrate; sonra agaroz ped yüzeyi yüzer. Bir solucan almak kullanarak normal bir plaka solucan aktarın. Agaroz ped, tampon ve solucanlar artık uymak çok doymuş hale kadar birkaç kez daha tekrar edilebilir.
Transgenik seçimi
- Enjekte solucanlar, P 0 nesil, bireysel taze, bakteriyel numaralı seribaşı levhalar (60 mm) aktarılır ve üremek için izin verilir. Tipik olarak, enjekte edilen hayvanların yavrular ortaya çıkıncaya kadar 2-3 gün süreyle 20 ° C'de inkübe edilir.
- F 1 yavrular floresan stereomikroskopta kullanarak transgenik marker (örneğin floresans) kanıt görülmektedir. Her floresan, taşıyıcı F 1, hayvan ayrı ayrı (her F 1 yavrulara ayrı bir hat kabul edilir) yeni bir plaka üzerine klonlanmış olduğunu. F 1 çift cinsiyetli, üremek için izin verilir . Yine, yavrular ortaya çıkıncaya kadar bu genellikle 20 ° C de 2-3 gün için yapılır.
- F 2 nesil transgenik hayvanlar için de görülmektedir. F 2 hayvan miras ve transgenik dizi ifade "istikrarlı" bir çizgi olarak kabul edilir .
NOT: F 1 styaşı birçok transgenik hayvanlar olabilir, ama onlar kararlı değildir. F 1 transgenik hayvanlar çoğunluğu F 2 istikrarlı hatları içine yayılır olmayacaktır.
NOT: gen kopya sayısı değişkenliği kontrol etmek için, en az enjekte inşa başına üç bağımsız sabit hatları oluşturur . - Her bağımsız istikrarlı bir çizgi solucanlar ayrı bir çizgi olarak muhafaza edilmelidir. Her satır, her nesil yeni bir plaka birkaç transgenik hayvanlar transfer tarafından yayılan olabilir; seçilebilir marker floresan ise bu floresan stereomikroskopta kullanarak yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu işlemi yaparken, hatırlamak önemlidir:
- Gonad merkezi içine doğrudan enjekte
- Çok fazla sıvı enjekte
- Kuruma önlemek için hızlı bir şekilde çalışır.
Çok büyük kırık gibi iğne ile ilgili sorunlar yaşarsanız, bu daha az ideal bir iğne ile enjekte etmeye çalışıyor yerine, taze bir iğne yeniden en iyisidir.
Transgenik solucanlar nesil gibi birçok uygulama vardır:
- Mutant genlerin belirlenmesi, dönüşüm kurtarma yöntemi denir
- Kesilmiş proteinleri ifade ile protein etki haritalama
- Hücresel ve hastalık süreçlerinin bir gen rol karakterizasyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz tüm Caldwell Lab üyeleri işbirliği ruhu kabul etmek istiyoruz. Bachmann-Strauss Distoni ve Parkinson Vakfı, Birleşik Parkinson Vakfı, Amerikan Parkinson Hastalığı Derneği, Parkinson Hastalığı Derneği Alabama, Michael J. Fox Parkinson Araştırma Vakfı ve Lisans Araştırma laboratuarında Hareket bozuklukları araştırma tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Halocarbon Oil, Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| Coverglass 18x18 mm | Fisher Scientific | 12-548-A | ||
| Coverglass 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| Coverglass 22x50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | ||
| 100 ul Capillary | VWR international | 53432-921 | ||
| Glass Capillary for Needles | "Kwik-Fil" | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Needle Puller | Tool | Narishige International | Model PP-830 | |
| microINJECTOR System | Tritech Research, Inc. | MINJ-1000 | Scope, Stage, Manipulator | |
| Dissecting, with Fluorescence | Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 |
References
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
