Summary
В этом видео показано, как использовать Элеганс C. оценить дофаминергических нейронов нейродегенерации в качестве модели для лечения болезни Паркинсона. Кроме того, генетические экраны используются для выявления факторов, которые либо повышения дегенерация или нейропротекторное.
Abstract
Улучшение диагностики и лечения болезни Паркинсона (БП), зависят от знания о восприимчивости факторов, которые оказывают групп риска. В процессе попытки выявить новые генетические факторы, связанные с ПД, ученые сформировали множество списков кандидатов генов, полиморфизмы, и белки, которые представляют собой важные достижения, но это приводит остаются неопределенными механистически. Наша работа направлена на значительное сужение такие списки, используя преимущества простой модели системы животного. Хотя люди имеют миллиарды нейронов, микроскопических круглых червей Caenorhabditis Элеганс имеет ровно 302, из которых только восемь производство допамина (ДА) в hemaphrodites. Выражение человеческого гена, кодирующего PD-связанных белков, альфа-синуклеина, в Элеганс C. Д. А. Результаты нейронов в дозировке и возраст-зависимых нейродегенерации.
Черви выражения человеческих альфа-синуклеина в нейронах DA являются изогенных и выразить как GFP и человеческий альфа-синуклеина под промоутером Д. транспортер (Pdat-1). Наличие GFP служит легко визуализировать маркером следующее DA нейродегенерации у этих животных. Сначала мы показали, что альфа-синуклеина вызванных Д. нейродегенерации можно было спасти этих животных от torsinA, белок с молекулярной активности шаперона 1. Кроме того, кандидат, связанных с ПД генов, определенные в нашей лаборатории с помощью крупномасштабного скрининга RNAi усилия использовании альфа-синуклеина неправильного сворачивания анализа были затем вытесняется в Элеганс C. Д. нейронов. Мы решили, что пять из семи генов испытания представляют собой важные модуляторы кандидат PD, как они спасли альфа-синуклеина вызванной нейродегенерации Д. А. 2. Кроме того, лаборатория Линдквист (этот вопрос Юпитера) выступал дрожжей экранах которых альфа-синуклеина зависит от токсичности используется как для считывания генов, которые могут усиливать или подавлять цитотоксичности. Впоследствии мы изучили гены дрожжей кандидата в нашем C. Элеганс альфа-синуклеина вызванной нейродегенерации анализа и успешно проверены многие из этих целей 3, 4.
Наша методика включает в себя генерацию Д. С. Элеганс нейрон-специфическая экспрессия вектора с использованием рекомбинационной клонирование кДНК генов-кандидатов под контролем Pdat-1 промоутера. Эти плазмиды затем microinjected в дикого типа (N2) червей, а также селективного маркера для успешной трансформации. Несколько стабильной трансгенных линий производства кандидата белка в нейронах Д. получаются, а затем самостоятельно перешли в альфа-синуклеина дегенеративные деформации и оценены на нейродегенерации, как на животных и на индивидуальном уровне нейрона, в течение старения.
Protocol
А. Выражение плазмиды Строительство
Два плазмид требуются: одна для тканеспецифические экспрессии гена интересов и второй, как селективного маркера преобразований (хотя и маркер плазмиды, как правило, доступны из научно-исследовательского сообщества).
Экспериментальные плазмиды
- Выберите промоутер, что выражается в ткани / тип клеток интересов; в этом случае перевозчик DA (Pdat-1) промоутер используется. Это выражение плазмида была создана как шлюз Invitrogen-совместимая система вектор назначения (pDEST-DAT-1), чтобы вставки любого интересующего гена вниз по течению от промотора рекомбинационной клонирования 1.
- КДНК гена интерес усиливается ПЦР с использованием праймеров, содержащих шлюз ATT B рекомбинационной последовательности. Усиливается кДНК первой объединить в донора вектор pDONR201, чтобы создать запись вектор, а затем трансформируется в штамм кишечной палочки DH5α. После выбора успешных рекомбинантов и мини-приготовительные изолирования ДНК, вступление вектор объединить в pDEST-DAT-1 вектор назначения для создания выражения плазмиды. Подробности о рекомбинационной клонирования можно получить либо ручной шлюз Invitrogen или в Колдуэлл и соавт. 5.
Выбор Маркера плазмиды
Трансгенных маркер плазмида состоит из вектор с промоутером вождения выражение флуоресцентного белка в очевидных ткани. В этой конкретной процедуры, UNC-54 промоутер диски вишня экспрессии белка в мышцах стенки тела (Punc-54:: вишня).
Б. поколение трансгенных C. Элеганс через Микроинъекция
См. соответствующую статью Юпитера: http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833
C. Генетические кресты анализа нейродегенерации Д.А.
- Черви выращиваются с использованием стандартных процедур 6.
- Место 10 Pdat-1:: α-син; Pdat-1:: GFP мужчин 1, 2 на спаривание пластины с 3-4 L4 этапе гермафродитов трансгенных (выражая Pdat-1:: ген Х и Punc-54:: вишня) . Это должно быть выполнено индивидуально для каждой из трех отдельных устойчивых линий созданы. После двух дней, удалите мужчин.
- Осмотрите поколения F1, и если Есть несколько мужчин потомства, спаривание прошло успешно.
- Клон из 5 гермафродит L4 животных друг от креста, которые обладают как Pdat-1:: GFP флуоресцентного маркера (наследуется от родителей мужчины) и Punc-54:: вишня флуоресцентные мышцах стенки тела маркера (наследуется от родительского гермафродит). Клонированных животных должны быть в L4 этапе, чтобы убедиться, что они еще не повязана с мужским животных, находящихся на тарелку. Позвольте им самостоятельно крест и производят потомство F2.
- F2 животных, произведенных в шаге 3, клонированных из. В частности, передача ~ 5-10 животных, которые обладают как флуоресцентных маркеров для своих отдельных пластин. Экран F3 поколения для пластин, где 100% животных выразить GFP в DA нейронов и некоторые животные выражают вишни в теле клеток стенок мышцы. Эти животные будут гомозиготных по Pdat-1:: α-син; Pdat-1:: GFP ген в то время как стабильно передаче вновь созданному трансгенов (ген X).
Д. дофаминергической Нейрон Анализ
- Подготовка свежие пластины для каждой из трех линий, созданный выше, а также Pdat-1:: α-син; Pdat-1:: GFP один штамм. Дайте им возможность достичь совершеннолетия.
- Передача 30-40 трансгенных взрослых из каждой строки на свежие пластины. Позвольте им лежать эмбрионов в течение 4 часов при температуре 20 º C.
- Удалить взрослых. Разрешить эмбрионов развиваться в течение 3-4 дней при температуре 20 º C, пока не достигнут стадии L4.
- Pick ~ 100 L4 трансгенных животных пластины, содержащей 0,04 мг / мл 5-фтор-2'-дезоксиуридина (ФУДР). Это аналогом нуклеотидов развития блоки нового поколения путем ингибирования синтеза ДНК, предотвращая таким образом потомство от подавляющего экспериментальных животных 7. Защита ФУДР пластин от света, поскольку он является светочувствительным.
- Взрослые животные будут проанализированы на различных дней после откладки яиц. Соответствующие дни анализа определяются эмпирически. Например, мы определили, что 77%, 87% и 90% Pdat-1:: α-син; Pdat-1:: GFP животных выставку выродились DA нейронов в дни 6, 7 и 10 сообщение развития, соответственно. Поэтому, если мы предсказываем, что трансгенная интерес могли бы повысить нейродегенерации, мы будем анализировать в день 6 и / или 7. Кроме того, трансгенов, которые могут подавлять нейродегенерации будут проанализированы в дни 7 и 10.
- Сделайте 4 свежих колодки агарозы (в отличие от прокладки микроинъекции агар, они используются свежие и не высыхать). Установите две предметные стекла, которые имеют кусок ленты через них; лента служит для Spacer самое толстыми клавиатурами. Положите 1 / 3слайд между ними на скамье (они расположены три в ряд). Место капли расплавленного агарозы по центру слайда и быстро лежал еще один слайд на вершине агарозы, перпендикулярно и во всех трех слайдов. Сделайте несколько дополнительных колодки, оставив два слайда вместе, пока площадка готова к использованию.
- Для анализа червя Д. нейронов, место 6 мкл капли 3 мМ левамизол (анестетик) по 22 х 30 мм, стеклянная крышка. Выберите 40 взрослых животных (10 дополнительных за 30 до быть засчитан) в капле, затем инвертировать покровного стекла на площадку агарозы. Повторите эти действия для каждой из других линий.
- Оценка 30 животных в каждой строке на предмет наличия каждого КЭП и АДЭ нейрона использованием сложного микроскопа с epifluorescence и фильтр куба, который позволяет визуализировать FITC или GFP. Мы используем Снабдим GFP HYQ фильтр куб (Chroma Technology). Запись данных на листе бумаги скоринга. Животных дикого типа сохранят полную флуоресценции GFP во всех 4-CEP и 2 нейронами ADE. Индивидуальные животных выставке потерей нейронов Д. оцениваются как не-WT или "вырождается". Кроме того, степень вырождения может быть засчитан путем подсчета общего нейроны потеряли в каждом животном, а также населения.
- Повторите анализ еще 2 раза (еще 30 животных в каждой строке в суде). Общее количество червей выставке дикого типа DA нейроны от трех раундов анализы усредняется. Статистический анализ для нейропротекции затем выполняется с помощью Стьюдента-теста (р <0,05), для сравнения контроль черви (Pdat-1:: α-син; Pdat-1:: GFP) со штаммами, что более-экспресс генов-кандидатов в нейронах Д.А. .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Возрастной потерей дофаминовых нейронов, клинические признаком болезни Паркинсона и была связана с накоплением или неправильного сворачивания белка, называемого альфа-синуклеина. Здесь показано, как на этикетке, с помощью флуоресцентных трансгенов, дофаминергических нейронов C. Элеганс и имитировать нейродегенерации видели при болезни Паркинсона путем coexpressing человека альфа-синуклеина в этих клетках.
Это видео показывает методологию для роста, генетические скрещивания, монтаж и озвучивание трансгенных нематод для оценки генетических факторов, которые либо повышения нейродегенерации или обеспечить нейропротекции в течение старения. Осторожность, чтобы использовать маркеры для обеспечения надлежащего трансгенов поставил мужчин и гермафродитов, чтобы обеспечить успешное генетических кресты, и последовательность в выигрыше потерю нейронов или защиты. Таким образом, С. Элеганс способствует быстрому оценки генетических факторов, которые могут либо способствовать, нейродегенерации или представляют терапевтических мишеней для повышения выживаемости нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотим отметить дух сотрудничества всех членов Колдуэлл Lab. Двигательные расстройства исследования в лаборатории была поддержана Бахман-Стросс дистонии и Паркинсона фонд, Соединенные Паркинсона Фонда, американский Паркинсона Болезнь ассоциации, Болезнь Паркинсона Ассоциации Алабама, Майкл Дж. Фокс Фонд исследований болезни Паркинсона, а Бакалавриат исследований
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3x1" | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon Instruments | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology Corp. |
References
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
