Tillämpning av en C. elegans Dopamin Neuron Degeneration-analys för validering av potentiella Parkinsons sjukdomsgener

Summary

Denna video visar hur du använder C. elegans för att bedöma dopaminerga neuron neurodegeneration som modell för Parkinsons sjukdom. Dessutom är genetiska skärmar används för att identifiera faktorer som antingen ökar degeneration eller är nervskyddande.

Abstract

Förbättringar av diagnos och behandling av Parkinsons sjukdom (PS) är beroende av kunskap om känslighet faktorer som gör befolkningar i riskzonen. I processen att försöka identifiera nya genetiska faktorer som är förknippade med PD har forskarna genererat många listor över gener, polymorfismer, och proteiner som representerar viktiga framsteg, men dessa leder fortfarande mekaniskt odefinierade. Vårt arbete riktar mot betydligt förträngning sådana listor genom att utnyttja fördelarna med en enkel djurmodell system. Medan människor har miljarder nervceller har mikroskopiska rundmasken Caenorhabditis elegans exakt 302, varav endast åtta producerar dopamin (DA) i hemaphrodites. Redovisning av en mänsklig gen som kodar för PD-associerad protein, alfa-synuklein, i C. elegans DA nervceller resultat i dosering och åldersberoende neurodegeneration.

Worms uttrycka mänskliga alfa-synuklein i DA nervceller isogena och uttrycka både GFP och mänskligt alfa-synuklein under DA transportör promotor (Pdat-1). Förekomsten av GFP fungerar som en lätt visualiseras markör för följande DA neurodegeneration i dessa djur. Vi visade från början att alfa-synuklein-inducerad DA neurodegeneration kunde räddas med dessa djur genom att torsinA, ett protein med molekylär förkläde aktivitet ^1. Vidare kandidat PD-relaterade gener identifierats i vårt labb via storskaliga RNAi screening insatser med hjälp av en alfa-synuklein misfolding analys då var överrepresenterade i C. elegans DA nervceller. Vi bestämde att fem av sju gener testas representerade betydande kandidat modulatorer av PD som de räddade alfa-synuklein-inducerad DA neurodegeneration ^2. Dessutom har Lindquist Lab (denna fråga av Jove) utförs jäst skärmar där alfa-synuklein-beroende toxicitet används som en avläsning av gener som kan förstärka eller undertrycka cytotoxicitet. Vi undersökte därefter gener jästen kandidat i vår C. elegans alfa-synuklein-inducerad neurodegeneration analys och framgångsrikt valideras många av dessa mål ^{3, 4.}

Vår metodik innebär generering av en C. elegans DA neuron-specifikt uttryck vektor med Rekombination kloning av cDNAs kandidat genen under kontroll av Pdat-1 promotor. Dessa plasmider är sedan idag injiceras i vildtyp (N2) maskar, tillsammans med en markör för en framgångsrik omvandling. Flera stabila transgena linjerna fram den kandidat proteinet i DA nervceller framställs och därefter självständigt gick in i alfa-synuklein degenerativa stam och utvärderas för neurodegeneration, både på djur och enskilda neuron nivå under loppet av åldrande.

Protocol

A. Expression Plasmid Construction

Två plasmider behövs: en för vävnadsspecifika uttryck av genen av intresse och en andra som valbar omvandling markör (om markör plasmiden är vanligtvis tillgänglig inom forskarsamhället).

Experimentell Plasmid

1. Välj en promotor som uttrycks i vävnaden / cellen typ av intresse, i detta fall, promotor DA transportör (Pdat-1) används. Detta uttryck plasmid skapades som en Invitrogen gateway-kompatibla destination vektor (pDEST-DAT-1) för att möjliggöra införandet av en gen av intresse nedströms arrangören genom Rekombination kloning ^1.
2. Den cDNA av genen av intresse PCR amplifieras med hjälp av primers som innehåller Gateway Att B Rekombination sekvens. Den förstärkta cDNA är först rekombinerat in givaren vektor pDONR201 att skapa posten vektor och sedan omvandlas till E. coli-stam DH5α. Efter urval av framgångsrika rekombinanter och mini-prep isolering av DNA, en post vektorn rekombinerat i pDEST-DAT-1 destinationen vektor för att skapa uttrycket plasmiden. Detaljer om Rekombination kloning är tillgängliga från antingen Invitrogen Gateway manuellt eller i Caldwell et al. ^5.

Markör Plasmid

En transgen markör plasmiden består av en vektor med en promotor köra ett uttryck för en fluorescerande proteinet på ett uppenbart vävnad. I just detta förfarande, driver UNC-54 promotor körsbär protein uttryck i kroppen väggen muskeln (punktlighet-54:: körsbär).

B. Generering av Transgena C. elegans via mikroinjektion

Se relaterade JUPITER artikel: http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833

C. Genetiska kors för DA neurodegeneration analys

1. Maskar odlas med hjälp av standardprocedurer ^6.
2. Placera 10 Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP hanar ^{1, 2} på en parning tallrik med 3-4 L4-stadium transgena hermafroditer (som uttrycker Pdat-1:: Gene X och punktlighet-54:: Cherry) . Detta bör göras individuellt för var och en av de tre separata skapade stabila linjer. Efter två dagar bort män.
3. Inspektera F1-generationen, om det finns flera manliga avkomma, var parning framgångsrik.
4. Klon ut 5 hermafrodit L4 djur från varje korsning som uppvisar både Pdat-1:: GFP fluorescerande markör (arv från den manliga föräldern) och punktlighet-54:: Cherry fluorescerande kroppen väggen muskler markör (ärvs från hermafrodit förälder). Den klonade djur måste vid L4-stadium för att säkerställa att de ännu inte har parat sig med manliga djur som finns på tallriken. Låt dem själva korset och producera F2 avkomma.
5. F2 djur produceras i steg 3 är klonade ut. Specifikt överföra ~ 5-10 djur som uppvisar både fluorescerande markörer till sina egna individuella tallrikar. Screen på F3 generationen för tallrikar där 100% av djuren uttrycka GFP i Da nervceller och några av djuren uttrycka körsbär i kroppen väggen muskelceller. Dessa djur kommer att vara homozygota för Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP-genen, medan stabilt sänder nyskapade transgenen (genen X).

D. Dopaminerga Neuron Analys

1. Förbered en ny plåt för vardera av de tre linjerna skapade ovan, liksom Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP ensam stam. Låt dem växa till vuxen ålder.
2. Överför 30-40 transgena vuxna från varje rad på en ny platta. Låt dem lägga embryon i 4 timmar vid 20 º C.
3. Ta bort de vuxna. Låt de embryon som utvecklas i 3-4 dagar vid 20 ° C tills de når L4 scenen.
4. Plocka ~ 100 transgena L4 djur till en skylt som innehåller 0,04 mg / ml 5-fluoro-2'-deoxiuridin (FUDR). Detta nukleotid analoga blockerar utvecklingen av nästa generation via hämning av DNA-syntesen och hindrar därmed avkomman från överväldigande försöksdjur ^7. Skydda FUDR plåtar från ljus eftersom det är ljuskänsligt.
5. Vuxna djur kommer att analyseras på olika dagar efter äggläggningen. Lämplig dagar av analysen bestäms empiriskt. Till exempel har vi fastställt att 77%, 87% och 90% av Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP djur uppvisar urartade DA nervceller i dag 6, 7 och 10 efter utveckling, respektive. Därför, om vi förutspår att transgenen av intresse kan öka neurodegeneration kommer vi att analysera på dag 6 och / eller 7. På samma sätt kommer transgener som kan hämma neurodegeneration analyseras på dag 7 och 10.
6. Gör 4 färska agaros kuddar (till skillnad från kuddar mikroinjektion agar, används dessa färska och får inte torka ut). Ställ ut två objektglas som har en bit tejp över dem, bandet fungerar som spacer för ekvivalent tjocka trampdynor. Lägg tredjedelglida mellan dem på bänken (de är placerade tre i bredd). Placera en droppe smält agaros på mitten bilden och snabbt lägger en annan bild ovanpå agaros, vinkelrätt mot och i alla tre bilder. Gör flera ytterligare kuddar, lämnar två bilder tillsammans tills plattan är klar för användning.
7. Att analysera mask DA nervceller, placera en 6 l droppe 3 mM levamisol (ett bedövningsmedel) på en 22 x 30 mm skyddsglas. Plocka 40 vuxna djur (10 extra utöver de 30 som görs) i droppe, sedan vända på täckglaset på agarosen pad. Upprepa för varje av de övriga linjerna.
8. Betyg 30 djur per linje för närvaron av varje CEP och ADE neuron med hjälp av ett sammansatt mikroskop med epifluorescence och ett filter kub som tillåter visualisering av FITC eller GFP. Vi använder en begåva GFP HYQ filter kub (Chroma Technology). Spela in data på bifogad poäng bladet. Vildtyp djur kommer att behålla hela GFP fluorescens i alla 4 CEP och 2 nervceller ADE. Enskilda djur uppvisar förlust av DA neuron poängsätts som icke-WT eller "degenererade". På samma sätt kan omfattningen av degeneration görs genom att räkna den totala nervceller förlorade i varje djur, liksom befolkningen.
9. Upprepa analysen 2 gånger (30 fler djur per linje per försök). Det totala antalet maskar ställer ut vildtyp DA nervceller från de tre omgångarna av analyser är i genomsnitt. Statistisk analys för neuroprotektion sedan utförs med hjälp av Students t-test (p <0,05) att jämföra kontroll maskar (Pdat-1:: α-syn, Pdat-1:: GFP) med stammar att över-express kandidat gener i DA nervceller .

Discussion

Den åldersberoende förlusten av dopamin neuroner är en klinisk kännetecknande för Parkinsons sjukdom och har i samband med ackumulering eller misfolding av ett protein som kallas alfa-synuklein. Här visar vi hur du etikett, via en fluorescerande transgen dopaminerga nervceller av C. elegans och efterliknar neurodegeneration ses vid Parkinsons sjukdom genom coexpressing mänskligt alfa-synuklein i dessa celler.

Denna video visar metoden för tillväxt, genetisk korsning, montering och poängsättning av transgena nematoder att utvärdera genetiska faktorer som antingen ökar neurodegeneration eller ge neuroprotektion under loppet av åldrande. Man ser till att använda markörer för transgen underhåll lämpligt iscensatta manliga och hermafroditer att säkerställa ett framgångsrikt genetiska kors och konsekvens i att göra poäng neuron förlust eller skydd. På detta sätt, C. elegans underlättar snabb bedömning av genetiska faktorer som antingen kan bidra till neurodegeneration eller representerar terapeutiska mål för att öka neuron överlevnad.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Coverglass 20x30 mm		Fisher Scientific	12-548-5A
Microscope Slides	Plain, 3x1"	Fisher Scientific	12-549
Dissecting with Fluorescence	Microscope	Nikon Instruments	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon Instruments	SMZ645
Epifluorescent	Microscope	Nikon Instruments	Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ	Endow Bandpass	Chroma Technology Corp.