Summary
このビデオでは、線虫、C. elegansのシナプス機能を研究するために補完的な方法で2つのニューラル覚せい剤、アルジカルブとペンチレンテトラゾール（PTZ）を、採用する方法を示します。この補完的なアプローチは、変調神経同調のための進化的に保存のメカニズムに光を当てると、てんかんと発作のための意味を持つために使用することができます。
Abstract
線虫、線虫（Caenorhabditis elegans）は、神経伝達を研究するための方便モデルとなっている。その神経系の解剖学との接続は電子顕微鏡写真から決定および薬理学的アッセイによって洗練されているようにC. elegansは、動物モデルの中で一意です。このビデオでは、我々は、どのように2つの補完的な神経刺激剤アルジカルブと呼ばれるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を、記述し、ペンチレンテトラゾール（PTZ）と呼ばれるγ-アミノ酪酸（GABA）受容体拮抗薬は、、特にC. elegansの神経筋接合部での信号の特性評価に用いることができる（NMJs）と拮抗神経回路の我々の理解を促進する。
302 C. elegansのニューロン、19 GABA作動性D -型運動ニューロン神経支配の体壁の筋肉（BWMS）、の間RMEsと呼ばれる4つのGABA作動性ニューロン、、支配する頭の筋肉。逆に、三十から九運動ニューロンは、興奮性神経伝達物質、アセチルコリン（ACH）を発現し、運動を調整するBWMSでGABA伝達を拮抗する。体壁のNMJsにおけるGABA作動性およびコリン作動性運動ニューロンの拮抗性質は、最初にレーザーアブレーション法によって決定され、後でアルジカルブの曝露によってbuttressedした。時間の経過または野生型ワームにおいて用量反応性の麻痺の急性アルジカルブの暴露の結果。以下アセチルコリンがBWMSの少ない刺激につながる、ワームのNMJsで蓄積として、まだ、興奮性AChの伝送の損失は、アルジカルブに耐性を付与する。アルジカルブへの抵抗は、アセチルコリン固有のまたは一般的なシナプス機能の変異体で観察されることがあります。拮抗GABAおよびアセチルコリン伝達、GABA伝達の損失、または否定的にアセチルコリン放出を調節することが失敗と一致し、アルジカルブに過敏性を付与する。アルジカルブの曝露は神経伝達遺伝子の多数のワームのホモログの単離につながっているものの、アルジカルブの露出だけでは効率的に特定の線虫C. elegansの運動神経細胞の遺伝子とパスウェイのための支配的役割を決定することはできません。この目的のために、我々は、PTZを使用して補完的な実験的アプローチを、導入している。
神経伝達変異体は、PTZに対応しアルディカーブ誘導の麻痺とは異なる明確な表現型を、、が表示されます。野生型ワームだけでなく、アセチルコリンを放出または受信する場合は、特定の無能と変異体は、PTZに明らか感度を示していない。しかし、GABAの変異体、ならびに一般的シナプス機能の変異体は、時間経過や用量反応性の形で前方痙攣が表示されます。否定的に一般的な神経伝達物質の放出を調節し、従って、BWMSにアセチルコリンの過剰な量を分泌できない変異体は、PTZに麻痺する。離散的変異体のクラスのPTZ誘発性表現型は、C. elegansのアルジカルブ及びPTZ露出パラダイムと相補的なアプローチは、神経伝達の我々の理解を加速させる可能性があることを示している。また、我々は薬理学的アッセイを行う方法をデモビデオはC. elegansの研究のための一貫性のある方法を確立する必要があります。
Protocol
アルジカルブの露出パラダイム
- 初日には、各遺伝子型のと、各レプリケートのうち少なくとも30人の若い成人舞台のワームは、二日目アルジカルブアッセイのための利用可能になることを確認してください。実験者はE.を含む新鮮なNGMプレート上に50歳か以上のL4段階のワームを（最高のナイスタチンなし）、選択された場合、それがベストです食物源としての大腸菌 （できればOP50）、と（20 ° C 22〜25℃は大丈夫ですが° Cは、最適な）一貫性があり、許容温度で12-24時間のためにそれらを成長する。
- 二日目に、70％エタノール（EtOH）および30％のddH 2 Oでアルジカルブの100mMのストック溶液を作る希望アルジカルブの濃度を達成するために定義されたボリュームとNGMマイナスナイスタチンプレート上にアルジカルブの適切な量を広げる。我々は一貫して7.5 mLのNGMプレート上にめっきによって100mMのアルジカルブの37.5μLを0.5 mMのアルジカルブを使用してください。アルジカルブプレートは室温でおよそ30〜60分間乾燥することができます。それは蓋をクラックする必要はありません。また、アルジカルブはNGMに加え、4℃で一週間保存できます。
- E.の乾燥後、プレート一貫性のあるボリューム各アルジカルブプレートの中心と室温でさらに30〜60分間乾燥した上に大腸菌 （できれOP50）。過密なく、小さなスポットに集中してワームを保つために十分なサイズの食品の芝生を作成する私たちは常に板OP50の25μLを、。
- 食品の芝生が乾燥しているとき、人はアルジカルブアッセイを進めることができます。アルジカルブアッセイの主観的な性質のため、それは非常に実験は"盲目的に"実行することをお勧めします。主実験者の同僚は、定量するワームで、オリジナルのプレートを付け直すことができます。同様に、同僚は、タイマーを開始する前にすぐに暗号化さアルディカーブプレートにオリジナルのプレートからワームを転送することができます。実験者がそのようなuncoordinationなどの特徴的な表現型を持つワームの特定の株をアッセイ予想した場合、その後にもバイアスを減らすために類似の表現型を持つコントロールが存在する必要があります。さらに、それは実験の標準化を支援するために並行して、実験者は、アッセイ野生型株だけでなく、耐性株と過敏性ひずみを場合に最適です。実験者は、各複製のためのワームの一貫性のある数を分析するために努力すべきである。私たちは常に、各レプリケートするための単一の遺伝子型三十ワームを分析する。我々はまた、少なくとも3つを実行すると、各実験のために複製されます。経験豊富な実験者が一度に少なくとも6つの系統を分析することができるはずです。
- 白金線で一貫した方法で各ワームをつついによって麻痺したワームの数を数えます。我々は一貫して二回頭の上と二回尾三時間の合計は30分ごとに私たちのワームを突く。ポンピング咽頭の停止も麻痺を定義するために使用されるが、実験者は、すべてのアッセイ上麻痺の一貫した定義を採用している場合にのみすることができます。また、それは特に、いくつかのワーム、アルジカルブに耐性があるものは、プレートをオフクロールしようとする場合があることは注目に値する。このケースでは、実験者はアルディカーブプレートの周りに、パルミチン酸、ワームの運動への物理的な障壁の一貫性のある量を広げることができる。我々は10 mgパルミチン酸/ mLのエタノールの25μLを広げる。
PTZ露出パラダイム
- 初日には、各遺伝子型のと、各レプリケートのうち少なくとも30人の若い成人舞台のワームは、二日目のPTZアッセイのための利用可能になることを確認してください。実験者はE.を含む新鮮なNGMプレート上に50歳か以上のL4段階のワームを（最高のナイスタチンなし）、選択された場合、それがベストです食物源としての大腸菌 （できればOP50）、と（20 ° C 22〜25℃は大丈夫ですが° Cは、最適な）一貫性があり、許容温度で12-24時間のためにそれらを成長する。
- 二日目には、PTZ 0.5gのPTZ / mLののddH 2 Oのストック溶液を作る。希望するPTZ濃度を達成するために定義されたボリュームとNGMマイナスナイスタチンプレート上にPTZの適切な量を広げる。我々は7.5 mLのNGMプレート上にPTZの量を変えPTZ、我々プレートの用量反応アッセイを好むので。たとえば、あるは7.5 mLのNGMプレート上にプレートPTZストック溶液の37.5μLを5 mgのPTZ / mLの溶液を作成することがあります。 PTZプレートは室温でおよそ60〜120分間乾燥することができます。それは蓋をクラックする必要はありません。また、PTZはNGMに直接追加することができますが、それはすぐに凝固した後、アッセイに使用する必要があります。 PTZの安定性はアルジカルブの場合よりもかなり少なくなります。したがって、古いPTZプレートとアッセイは信頼性が低い。 PTZは、使用前に乾燥剤をデシケーター中で-20℃で保存してください。我々は安定性を確保するために、開封後約2ヶ月PTZを破棄することを好む。
- E.の乾燥後、プレート一貫性のあるボリューム大腸菌 （できれOP50）各PTZプレートの中央に、室温で別の30〜60分間乾燥した。過密なく、小さなスポットに集中してワームを保つために十分なサイズの食品の芝生を作成する私たちは常に板OP50の25μLを、。
- 食品の芝生が乾燥しているとき、人はPTZアッセイを進めることができます。 PTZアッセイはアルジカルブのアッセイよりも主観的ですが、それはまだ非常に実験は"盲目的に"実行することをお勧めします。主実験者の同僚は、定量するワームで、オリジナルのプレートを付け直すことができます。同様に、同僚は、タイマーを開始する前にすぐに暗号化さPTZプレートにオリジナルのプレートからワームを転送することができます。実験者がそのようなuncoordinationなどの特徴的な表現型を持つワームの特定の株をアッセイ予想した場合、その後にもバイアスを減らすために類似の表現型を持つコントロールが存在する必要があります。さらに、それは実験の標準化を支援するために並行して、実験者のアッセイ野生株だけでなく、前方または全身痙攣を有する株場合に最適です。実験者は、各複製のためのワームの一貫性のある数を分析するために努力すべきである。私たちは常に、各レプリケートするための単一の遺伝子型三十ワームを分析する。我々はまた、少なくとも3つを実行すると、各実験のために複製されます。経験豊富な実験は、一度に少なくとも3つの株を分析することができるはずです。ワームが麻痺になったり、場合によっては、薬剤に慣らしとしてはまだ、その後周波数と強度の暴露の15〜30分間の間に通常のピークPTZ誘発性痙攣の、とは減衰。
- 一時間の合計のための"てんかんのような"ワームをconvulsing 30分ごとの数を数えます。それは、フルボディの痙攣、全身麻痺、我々は"トニック"と呼ぶ、または組み合わせでワームの数とは別に、我々は"頭ボブ"と呼ぶ前痙攣、とワームの数を獲得するのが最適です我々は、"強直間代"と呼ぶBWM麻痺と前方痙攣、。単一の遺伝子型のほとんどのワームは、痙攣の1種類のみを示す。しかし、強直間代ワームは、しばしば完全に強壮剤になるので、一つはすべてのワームはすでに痙攣を展示している場合でも、30分を過ぎて分析を続ける必要があります。また、それはいくつかのワームは、プレートをオフクロールしようとする場合があることは注目に値する。このケースでは、実験者はPTZプレート周りのパルミチン酸の一貫性のある量を広げることができる。我々は10 mgパルミチン酸/ mLのエタノールの25μLを広げる。
アルジカルブ及びPTZに選択された線虫のシナプス伝達の変異体の行動反応
| 変異体名 | シナプスの役割 | 薬物なしで動作 | アルジカルブの行動反応（野生型N2に比べて） | PTZに対する行動反応 |
|---|---|---|---|---|
| トム- 1（ok188） | シナプス伝達を抑制する | まとまりのない | 麻痺の増強率 | 野生型と区別できない |
| UNC - 43（n498n1186） | 複雑 | まとまりのない | 麻痺の増強率 | 全身痙攣 |
| UNC - 25（e156） | GABA伝達を促進する | まとまりのない | 麻痺の増強率 | 前痙攣、全身麻痺 |
| SNB - 1（md247） | シナプス伝達を促進する | まとまりのない | 麻痺の減少率 | 前痙攣 |
| UNC - 4（E120） | アセチルコリン伝達を促進する | まとまりのない | 麻痺の減少率 | 野生型と区別できない |
ペンチレンテトラゾール（PTZ）と呼ばれる2つのニューラル覚醒剤、アルジカルブと呼ばれるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、およびGABA受容体拮抗薬は、、C. elegansのシナプス伝達の変異体を特徴づけるために相補的に使用することができます。過剰興奮性アセチルコリン（ACH）はAChの伝達（例えばタム- 1、UNC - 43）または抑制性GABA伝達（例えば、UNC - 25）の正の調節因子の負の調節に有害な突然変異からワーム体壁筋接合部（NMJs）に蓄積する。逆に、ワームのNMJsにおける興奮性AChのレベルは、一般的なシナプス伝達（例えば、SNB - 1）またはACH -特定の送信の遺伝子（例えば、UNC - 4）の正電圧レギュレータで、有害な突然変異によって減少する。低下興奮性AChの伝達と変異型ワームは、アルディカーブに誘導される麻痺の減少率を示すのに対し、野生型N2のワームと比較すると、NMJsで上昇興奮性AChの伝達と変異体のワームは、アルディカーブに誘導される麻痺の増強率を示す。 PTZはないアルジカルブとは異なり、線虫体壁筋で神経同期を中断しますが、PTZもC. elegansの頭部の筋肉に抑制GABAに拮抗する。その結果、アルジカルブの感度は、正確にPTZの感受性を予測することはできません。負または正のregul内の特定の欠陥を持つ変異体ワームアセチルコリン伝送の評価作業を容易には一般的なシナプス伝達または抑制性GABA伝達の展示堅牢なPTZ誘発性前部痙攣で特定の欠陥の正の調節に欠陥を持つ変異体ワームのに対し、PTZの存在下で野生型N2のワームから区別することはできません。また、UNC - 43の機能喪失変異体は、PTZの存在下で、フルボディの痙攣を表示し、おそらく彼らのユニークな薬剤応答に寄与する追加のシナプス伝達の異常を、持っている。
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Discussion
C.とアルジカルブ露出のための現在のプロトコル虫は、変異体の両方のクラスはアルジカルブに耐性を示すように実験者は、シナプス伝達における一般的な赤字とAChの伝達と変異体の特定の障害を持つ変異体を区別することはできません。同様に、アルジカルブは、変異体は変異の両方のクラスはアルジカルブに過敏症を示すように否定的に、アセチルコリンの伝達を調節するためにGABA伝達または一般的な障害で特定の障害を持っているかどうかを判断するために使用することはできません。アルジカルブ露出アッセイからの結果と組み合わせて私たちのPTZの曝露アッセイからの結果は、、研究者がよりよいシナプス伝達の変異体を特徴づけることができます。
C. elegansのシナプス伝達の変異体を相補アルジカルブ及びPTZの曝露のパラダイムで簡単な方法で分類される可能性があります。 PTZ誘発性前部痙攣とアルジカルブ耐性変異体は、一般的なシナプス機能の可能性が不足しています。逆に、PTZ誘発性前部痙攣なしアルジカルブ耐性変異体は、アセチルコリンの伝達に可能性が特に不足しています。 PTZ誘発性前方痙攣を示さないアルジカルブ過敏症、ある変異体は、おそらく否定的にアセチルコリンの伝達を調節するために失敗する。最後に、展示PTZ誘発性前方痙攣を行うアルジカルブ過敏症の変異体は、、欠乏性GABAです。
アルジカルブの曝露のユーティリティは、また別の実験者が頻繁に麻痺の定義を変えるているように、その主観によって弱められる。単一の実験の手法は、変動することができます。また、アルディカーブ露出ワームは、つついの多様な力に反応して異なる方法で移動する。麻痺ワームと応答性のワームとの違いはわずかな頭部または尾部の筋のように微妙なことができます。 Cの優れた特性のためアルジカルブアッセイを補完することに加え虫のシナプス伝達の変異体、PTZもアルジカルブに過敏で、特にシナプス伝達の変異体、それらの変異体を単離するために使用されることがあります。 PTZ露出を利用する実験者は、代わりに単にアルディカーブに誘導される麻痺の微妙な違いがあるため、前方の痙攣を調べる必要があります。>
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Acknowledgments
我々はすべてコールドウェル研究室のメンバーの協力精神を認識したい。ダイムの月からバジルオコナーScholarの賞と全米科学財団からGACへのキャリア賞だけでなく、ハワードヒューズ医学研究所からのアラバマの大学に学部研究科学プログラムグラント、神経細胞の興奮性に資金を提供しているとコールドウェルラボにおけるてんかんの研究。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
