Summary
Este vídeo demonstra como empregar dois estimulantes neural, aldicarb e pentilenotetrazol (PTZ), de forma complementar para estudar a função sináptica no nematóide, C. elegans. Esta abordagem complementar também podem ser usados para lançar luz sobre mecanismos evolutivamente conservados para sincronia neuronal modular e tem implicações para a epilepsia e convulsões.
Abstract
O nematóide, Caenorhabditis elegans, tornou-se um modelo conveniente para estudar a neurotransmissão. C. elegans é único entre os modelos animais, como a anatomia e conectividade de seu sistema nervoso foi determinada a partir de micrografias eletrônicas e refinado por ensaios farmacológicos. Neste vídeo, descrevemos como dois complementares estimulantes neural, um inibidor da acetilcolinesterase, chamado aldicarbe, e um ácido gama-aminobutírico (GABA) antagonista do receptor, chamado de pentilenotetrazol (PTZ), pode ser empregada para caracterizar especificamente sinalização em C. elegans junções neuromusculares (NMJs) e facilitar nossa compreensão da antagônicas circuitos neurais.
De 302 C. elegans neurônios, dezenove neurônios GABAérgicos D-tipo do motor corpo inervam os músculos da parede (BWMs), enquanto quatro neurônios GABAérgicos, chamado RMEs, músculos da cabeça inervam. Por outro lado, os neurônios do motor 39 expressar o neurotransmissor excitatório, a acetilcolina (ACh), e antagonizar a transmissão GABA em BWMs para coordenar a locomoção. A natureza antagônica dos neurônios motores GABAérgicos e colinérgicos em corpo NMJs parede foi inicialmente determinada por ablação a laser e, mais tarde reforçada pela exposição aldicarbe. Resultados aldicarbe aguda de exposição em uma paralisia tempo-curso ou dose-resposta no tipo selvagem worms. No entanto, a perda de transmissão ACh excitatórios confere resistência ao aldicarb, como ACh menos acumula em NMJs worm, levando a uma menor estimulação da BWMs. Resistência ao aldicarb pode ser observado com ACh-específicas ou gerais mutantes função sináptica. Consistente com GABA antagônicas e transmissão de ACh, a perda de transmissão GABA, ou uma falta de regular negativamente ACh lançamento, confere hipersensibilidade ao aldicarbe. Embora a exposição aldicarbe levou ao isolamento de vírus homólogos numerosos genes de neurotransmissão, a exposição aldicarbe por si só não pode determinar de forma eficiente papéis predominantes para os genes e as vias de neurônios específicos C. elegans motor. Para esse fim, introduzimos uma abordagem complementar experimental, que usa PTZ.
Mutantes neurotransmissão exibir fenótipos clara, distinta de aldicarbe induzida por paralisia, em resposta a PTZ. Do tipo selvagem worms, bem como os mutantes com incapacidades específicas para liberar ou receber ACh, não mostram sensibilidade aparente para PTZ. No entanto, os mutantes GABA, bem como em geral os mutantes função sináptica, display convulsões anterior de uma maneira tempo-curso ou dose-resposta. Mutantes que não podem regular negativamente a liberação do neurotransmissor em geral e, assim, secretam quantidades excessivas de ACh em BWMs, tornam-se paralisado em PTZ. Os fenótipos PTZ-induzida de discreta aulas mutante indicam que uma abordagem complementar com aldicarb e paradigmas exposição PTZ em C. elegans pode acelerar nossa compreensão da neurotransmissão. Além disso, vídeos demonstrando como realizamos os ensaios farmacológicos devem estabelecer métodos consistentes para C. elegans pesquisa.
Protocol
Aldicarbe Paradigm Exposição
- No primeiro dia, garantir que pelo menos trinta vermes adultos jovens estágio de cada genótipo e de cada repetição estará disponível para ensaios aldicarbe no segundo dia. É melhor se um experimentador seleciona cinquenta ou mais vermes estágio L4 em placas NGM fresco (melhor sem nistatina), que contêm E. coli (de preferência OP50) como fonte de alimento, e cultivá-las por 12-24 horas a uma temperatura constante e permissivo (20 ° C a 22 ° C é melhor, apesar de 25 ° C está bem).
- No segundo dia, fazer uma solução estoque 100 mM de aldicarbe com etanol 70% (EtOH) e 30% DDH 2 O. Espalhe a quantidade adequada de aldicarbe em NGM menos nistatina placas com volumes definidos para alcançar as concentrações de aldicarb desejado. Nós sempre usar 0,5 mM aldicarbe por plaqueamento 37,5 mL de 100 mM aldicarbe em 7,5 mL placas NGM. Permitir que as placas de aldicarbe para secar por cerca de 30-60 minutos em temperatura ambiente. Não é necessário para quebrar as tampas. Alternativamente, aldicarb podem ser adicionados a NGM e armazenados a 4 ° C durante uma semana.
- Após a secagem da placa, volumes consistente de E. coli (de preferência OP50) para o centro de cada prato aldicarbe e secar por mais 30-60 minutos em temperatura ambiente. Nós placa consistentemente 25 mL de OP50, o que cria um gramado alimentos tamanho suficiente para manter os worms concentrados em um local pequeno, sem superlotação.
- Quando o alimento é gramado seco, pode-se prosseguir com testes de aldicarbe. Devido à natureza subjetiva de ensaios aldicarb, é altamente recomendado que as experiências sejam realizadas "às cegas". Um colega do experimentador primária pode re-rotular as placas originais com worms a ser testada. Da mesma forma, o colega poderia transferir worms das placas originais para placas aldicarbe ciphered imediatamente antes de iniciar um temporizador. Se o experimentador antecipa assaying uma cepa particular de worms com um fenótipo característico, tais como incoordenação, então também deve haver um controle com um fenótipo semelhante para reduzir viés. Além disso, é melhor se o experimentador ensaios uma cepa do tipo selvagem, assim como uma cepa resistente e uma estirpe de hipersensibilidade, em paralelo para ajudar a padronizar os experimentos. O pesquisador deve se esforçar para analisar um número consistente de worms para cada repetição. Estamos constantemente analisar thirty worms de um genótipo único para cada repetição. Nós também realizar pelo menos três repetições para cada experimento. Um experimentador experiente deve ser capaz de analisar, pelo menos, seis estirpes de cada vez.
- Contar o número de worms paralisado por insistência de uma forma consistente de cada verme com um fio de platina. Estamos constantemente nossos produtos worms duas vezes na cabeça e duas vezes na cauda a cada 30 minutos para um total de três horas. Cessação do bombeamento da faringe também pode ser usado para definir a paralisia, mas apenas se o pesquisador emprega uma definição consistente de paralisia de todos os ensaios. Além disso, é importante notar que alguns vermes, especialmente aqueles que são resistentes ao aldicarb, pode tentar rastejar fora do prato. Neste caso, o pesquisador pode se espalhar uma quantidade consistente de ácido palmítico, uma barreira física para locomoção worm, em torno das placas aldicarbe. Nós espalhamos 25 mL de ácido palmítico 10 mg / mL EtOH.
PTZ Paradigm Exposição
- No primeiro dia, garantir que pelo menos trinta vermes adultos jovens estágio de cada genótipo e de cada repetição estará disponível para ensaios PTZ no segundo dia. É melhor se um experimentador seleciona cinquenta ou mais vermes estágio L4 em placas NGM fresco (melhor sem nistatina), que contêm E. coli (de preferência OP50) como fonte de alimento, e cultivá-las por 12-24 horas a uma temperatura constante e permissivo (20 ° C a 22 ° C é melhor, apesar de 25 ° C está bem).
- No segundo dia, fazer um 0,5 g PTZ / mL solução estoque DDH 2 O de PTZ. Espalhe a quantidade adequada de PTZ para NGM menos placas nistatina com volumes definidos para alcançar as concentrações PTZ desejado. Porque preferimos dose-resposta ensaios para PTZ, nós placa quantidades variadas de PTZ para 7,5 mL placas NGM. Por exemplo, pode-se 37,5 mL placa da solução-mãe PTZ em uma placa NGM 7,5 mL para fazer uma solução de 5 mg PTZ / mL. Permitir que as placas PTZ para secar por cerca de 60-120 minutos em temperatura ambiente. Não é necessário para quebrar as tampas. Alternativamente, PTZ podem ser adicionados diretamente a NGM, mas deve ser imediatamente utilizada para os ensaios, quando solidificar. A estabilidade do PTZ é consideravelmente menor do que a de aldicarbe. Portanto, os ensaios com placas PTZ mais velhos são menos confiáveis. PTZ devem ser armazenadas a -20 ° C em um dessecador com um agente de secagem antes do uso. Nós preferimos descartar PTZ cerca de dois meses após a abertura para assegurar a estabilidade.
- Após a secagem da placa, volumes consistente de E. coli (de preferência OP50)para o centro de cada prato PTZ e secar por mais 30-60 minutos em temperatura ambiente. Nós placa consistentemente 25 mL de OP50, o que cria um gramado alimentos tamanho suficiente para manter os worms concentrados em um local pequeno, sem superlotação.
- Quando o alimento é gramado seco, pode-se prosseguir com testes de PTZ. Embora ensaios PTZ são menos subjetivos que os ensaios aldicarb, ainda é altamente recomendado que as experiências sejam realizadas "às cegas". Um colega do experimentador primária pode re-rotular as placas originais com worms a ser testada. Da mesma forma, o colega poderia transferir worms das placas originais para placas PTZ ciphered imediatamente antes de iniciar um temporizador. Se o experimentador antecipa assaying uma cepa particular de worms com um fenótipo característico, tais como incoordenação, então também deve haver um controle com um fenótipo semelhante para reduzir viés. Além disso, é melhor se o experimentador ensaios uma cepa do tipo selvagem, assim como com cepas anterior ou de corpo inteiro convulsões, em paralelo para ajudar a padronizar os experimentos. O pesquisador deve se esforçar para analisar um número consistente de worms para cada repetição. Estamos constantemente analisar thirty worms de um genótipo único para cada repetição. Nós também realizar pelo menos três repetições para cada experimento. Um experimentador experiente deve ser capaz de analisar, pelo menos, três cepas de cada vez. No entanto, a freqüência ea intensidade das convulsões induzidas por PTZ-geral pico entre 15-30 minutos de exposição, e depois como worms atenuar-se paralisado ou, em alguns casos, se aclimatar à droga.
- Contar o número de "epilepsia-like" convulsão worms a cada 30 minutos para um total de uma hora. É melhor para marcar o número de vermes com convulsões anterior, que chamamos de "cabeça-bobs", separada do número de vermes com o corpo inteiro convulsões, paralisia de corpo inteiro, o que chamamos de "tônico", ou uma combinação de convulsões anterior com paralisia BWM, que chamamos de "tônico-clônicas". A maioria dos worms de um genótipo único exibem somente um tipo de convulsão. No entanto, tônico-clônicas worms muitas vezes se tornam completamente tônico, por isso deve-se continuar o ensaio últimos 30 minutos, mesmo se todos os worms já exibiu convulsões. Além disso, é importante notar que alguns vermes podem tentar rastrear fora do prato. Neste caso, o pesquisador pode se espalhar uma quantidade consistente de ácido palmítico em torno das placas PTZ. Nós espalhamos 25 mL de ácido palmítico 10 mg / mL EtOH.
As respostas comportamentais dos selecionados C. elegans Mutants Transmissão Synaptic para aldicarbe e PTZ
| Nome mutante | Papel Synaptic | Comportamento sem Drogas | Resposta comportamental de Aldicarb (em comparação ao tipo selvagem do N2) | Resposta comportamental para PTZ |
|---|---|---|---|---|
| tom-1 (ok188) | inibe a transmissão sináptica | descoordenada | taxa aumentada de paralisia | indistinguível de tipo selvagem |
| unc-43 (n498n1186) | complexo | descoordenada | taxa aumentada de paralisia | de corpo inteiro convulsões |
| unc-25 (e156) | promove a transmissão GABA | descoordenada | taxa aumentada de paralisia | convulsões anterior, de corpo inteiro paralisia |
| snb-1 (md247) | promove a transmissão sináptica | descoordenada | taxa reduzida de paralisia | convulsões anterior |
| unc-4 (E120) | ACh promove a transmissão | descoordenada | taxa reduzida de paralisia | indistinguível de tipo selvagem |
Dois estimulantes neural, um inibidor da acetilcolinesterase, chamado aldicarbe e um antagonista dos receptores GABA, chamado pentilenotetrazol (PTZ), pode ser usado de forma complementar para caracterizar C. elegans mutantes transmissão sináptica. Acetilcolina excitatórios em excesso (ACh) se acumula no corpo de verme parede neuromuscular junções (NMJs) de mutações deletérias em reguladores negativos da ACh transmissão (por exemplo, tom-1 e unc-43) ou reguladores positivos da transmissão inibitória GABA (por exemplo, unc-25). Inversamente, os níveis de excitação ACh em NMJs verme são obscurecidos por mutações deletérias em reguladores positivos da transmissão sináptica geral (por exemplo, snb-1) ou ACh genes específicos de transmissão (por exemplo, unc-4). Quando comparado com vermes do tipo selvagem N2, worms mutante com elevada transmissão de ACh excitatórios na NMJs apresentam acréscimos de aldicarbe induzida por paralisia, enquanto worms mutante com baixa transmissão ACh excitatórios demonstram taxas reduzidas de aldicarbe induzida por paralisia. Embora PTZ interrompe sincronia neuronal em C. elegans músculos da parede do corpo, não muito diferente aldicarb, PTZ também antagoniza inibitória GABA em músculos da cabeça C. elegans. Como resultado, a sensibilidade aldicarbe não pode prever com precisão a sensibilidade PTZ. Worms mutantes com defeitos específicos no regul negativo ou positivoção da transmissão ACh são indistinguíveis dos vermes do tipo selvagem N2 na presença de PTZ, enquanto worms mutantes com defeitos na regulação positiva da transmissão sináptica geral ou defeitos específicos na exposição a transmissão inibitória GABA robusta PTZ convulsões induzidas anterior. Além disso, unc-43-perda da função-mutantes mostrar de corpo inteiro convulsões na presença de PTZ e provavelmente outras anormalidades transmissão sináptica, que contribuem para as suas respostas droga única.
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Discussion
Os protocolos atuais para a exposição com aldicarb C. elegans não permitem que pesquisadores a distinguir entre mutantes com déficits específicos de ACh transmissão e mutantes com déficits generalizados na transmissão sináptica, como ambas as classes de mutantes apresentam resistência ao aldicarbe. Da mesma forma, aldicarbe não pode ser usado para determinar se os mutantes têm déficits específicos na transmissão GABA ou falhas generalizadas para regular negativamente ACh transmissão, como ambas as classes de mutantes apresentam hipersensibilidade ao aldicarbe. Resultados de nossos testes de exposição PTZ, quando combinado com os resultados de ensaios de exposição aldicarb, permite aos pesquisadores para melhor caracterizar mutantes transmissão sináptica.
C. elegans mutantes transmissão sináptica pode ser classificado de maneira direta por aldicarb complementares e paradigmas exposição PTZ. Mutantes resistentes aldicarbe com PTZ convulsões induzidas anterior provavelmente deficiente em função sináptica geral. Por outro lado, os mutantes resistentes aldicarbe PTZ sem convulsões induzidas anterior é provável especificamente deficiente em ACh transmissão. Mutantes com hipersensibilidade aldicarb, que não apresentam PTZ convulsões induzidas anterior, provavelmente não conseguem regular negativamente a transmissão ACh. Finalmente, os mutantes com aldicarb hipersensibilidade, que exibem PTZ convulsões induzidas anterior, é provável GABA deficiente.
O utilitário de exposição aldicarb também é enfraquecida por sua subjetividade, como experimentadores diferentes, muitas vezes têm diferentes definições de paralisia. A única técnica experimentador também pode flutuar. Worms também, aldicarb expostas move de forma diferente em resposta às diversas forças de estímulo. A distinção entre um verme paralisado e um verme resposta pode ser tão sutil quanto uma cabeça leve ou twitch cauda. Além de complementar os ensaios aldicarbe para melhor caracterização de C. mutantes transmissão sináptica elegans, PTZ também pode ser usado para isolar mutantes transmissão sináptica, especialmente aqueles mutantes com hipersensibilidade ao aldicarbe. Experimentadores, que utilizam a exposição PTZ, pode simplesmente olhar para convulsões anterior, em vez de diferenças sutis em aldicarbe induzida por paralisia.>
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o espírito cooperativo de todos os membros Caldwell Lab. A Basil O'Connor Scholar Award da March of Dimes e uma concessão de CARREIRA do National Science Foundation para GAC, bem como uma Bolsa de Investigação Graduação Programa de Ciência da Howard Hughes Medical Institute para a Universidade do Alabama, ter financiado a excitabilidade neuronal e pesquisa da epilepsia no Laboratório de Caldwell.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
