Summary
В этом видеоролике показано, как использовать два нервных стимуляторов, альдикарб и pentylenetetrazole (PTZ), в дополнительных способов изучения синаптической функции в нематода C. Элеганс. Этот дополнительный подход может также использоваться, чтобы пролить свет на эволюционно консервативных механизмов для модуляции нейронной синхронии и имеет значение для лечения эпилепсии и эпилептические припадки.
Protocol
Альдикарб выдержки Paradigm
- В первый день, чтобы по крайней мере тридцати молодых взрослой стадии червей каждого генотипа и каждой репликации будут доступны для альдикарб пробы на второй день. Лучше всего, если экспериментатор выбирает пятьдесят и более L4 червей стадии в свежем пластин NGM (лучше без нистатин), которые содержат Е. палочка (желательно OP50) в качестве источника пищи, и выращивают их в течение 12-24 часов при последовательной и разрешительной температуре (20 ° С до 22 ° C лучше, хотя 25 ° C в порядке).
- На второй день, сделайте 100 мМ исходный раствор альдикарб с 70% этанола (этанол) и 30% DDH 2 O. Распространение соответствующее количество альдикарб на NGM минус нистатин пластин с определенными объемами для достижения желаемого концентрации альдикарб. Мы последовательно использовать 0,5 мМ альдикарб при посеве 37,5 мкл 100 мМ альдикарб на 7,5 мл NGM пластин. Разрешить альдикарб пластин высохнуть в течение примерно 30-60 минут при комнатной температуре. Это не обязательно, чтобы взломать крышками. Кроме того, альдикарб могут быть добавлены к НГО и хранили при 4 ° С в течение одной недели.
- После сушки пластины соответствуют объемам Е. палочка (желательно OP50) на центре каждой пластины альдикарб и сухой в течение еще 30-60 минут при комнатной температуре. Мы последовательно пластины 25 мкл OP50, что создает достаточный размер пищи газон держать червей сконцентрированы в небольшом месте без переполненности тюрем.
- Когда пища газона сухая, можно приступить альдикарб анализов. Из-за субъективного характера анализы алдикарб, настоятельно рекомендуется, что эксперименты проводить "вслепую". Коллега первичной экспериментатор может повторно маркировать оригинальных пластин с червями, чтобы быть проанализированы. Кроме того, коллеги могли передать червей от первоначального пластины зашифрованные пластин альдикарб непосредственно перед началом таймера. Если экспериментатор предполагает опробование конкретного штамма червей с характерным фенотипом, таких как uncoordination, то должно быть управление с аналогичными фенотип уменьшения систематической ошибки. Кроме того, это лучше, если экспериментатор анализов штамма дикого типа, а также устойчивый штамм и сверхчувствительным напряжения, параллельно, чтобы помочь стандартизировать экспериментов. Экспериментатор должен стремиться, чтобы проанализировать соответствует количество червей для каждой репликации. Мы постоянно анализируем тридцать червей одного генотипа для каждой репликации. Мы также осуществляем по крайней мере три повторяет для каждого эксперимента. Опытный экспериментатор должен иметь возможность анализировать не менее шести штаммов одновременно.
- Подсчитайте количество парализована червей подталкивая в согласованном порядке каждого червя с платиновой проволоки. Мы последовательно подтолкнуть наших червей в два раза по голове и два раза на хвост каждые 30 минут в общей сложности три часа. Прекращение глотки насосные также может быть использован для определения паралич, но только если экспериментатор использует последовательное определение паралич на все анализы. Кроме того, стоит отметить, что некоторые черви, особенно те, которые устойчивы к алдикарб, может попытаться ползти от пластины. В этом случае экспериментатор может распространиться последовательной количество пальмитиновая кислота, физический барьер для передвижения червей, около альдикарб пластин. Выкладываем 25 мкл 10 мг пальмитиновая кислота / мл этанола.
PTZ выдержки Paradigm
- В первый день, чтобы по крайней мере тридцати молодых взрослой стадии червей каждого генотипа и каждого повторить будет доступен для тестов PTZ на второй день. Лучше всего, если экспериментатор выбирает пятьдесят и более L4 червей стадии в свежем пластин NGM (лучше без нистатин), которые содержат Е. палочка (желательно OP50) в качестве источника пищи, и выращивают их в течение 12-24 часов при последовательной и разрешительной температуре (20 ° С до 22 ° C лучше, хотя 25 ° C в порядке).
- На второй день, сделайте 0,5 г PTZ / мл DDH 2 O исходного раствора PTZ. Распространение соответствующее количество PTZ на NGM минус нистатин пластин с определенными объемами для достижения желаемого концентрации PTZ. Потому что мы предпочитаем доза-реакция анализы для PTZ, мы пластины различного количества PTZ на 7,5 мл NGM пластин. Например, можно пластины 37,5 мкл исходного раствора PTZ на 7,5 пластины NGM мл, чтобы сделать 5 мг PTZ / мл раствора. Разрешить PTZ пластин высохнуть в течение примерно 60-120 минут при комнатной температуре. Это не обязательно, чтобы взломать крышками. Кроме того, PTZ могут быть добавлены непосредственно в НГО, но она должна быть немедленно использованы для анализов после затвердевания. Стабильность PTZ значительно меньше, чем у альдикарб. Таким образом, тесты со взрослыми пластин PTZ являются менее надежными. PTZ следует хранить при температуре -20 ° С в сушильном шкафу с сушильного агента перед использованием. Мы предпочитаем отказаться от PTZ примерно через два месяца после открытия, чтобы обеспечить стабильность.
- После сушки пластины соответствуют объемам Е. палочка (желательно OP50)на центре каждой пластины PTZ и сухой в течение еще 30-60 минут при комнатной температуре. Мы последовательно пластины 25 мкл OP50, что создает достаточный размер пищи газон держать червей сконцентрированы в небольшом месте без переполненности тюрем.
- Когда пища газона сухая, можно продолжить анализы PTZ. Хотя PTZ анализы менее субъективным, чем анализы алдикарб, он по-прежнему настоятельно рекомендуется проводить эксперименты «вслепую». Коллега первичной экспериментатор может повторно маркировать оригинальных пластин с червями, чтобы быть проанализированы. Кроме того, коллеги могли передать червей от первоначального пластины зашифрованные пластин PTZ непосредственно перед началом таймера. Если экспериментатор предполагает опробование конкретного штамма червей с характерным фенотипом, таких как uncoordination, то должно быть управление с аналогичными фенотип уменьшения систематической ошибки. Кроме того, это лучше, если экспериментатор анализов штамма дикого типа, а также штаммов с передним или полным тело конвульсии, параллельно, чтобы помочь стандартизировать экспериментов. Экспериментатор должен стремиться, чтобы проанализировать соответствует количество червей для каждой репликации. Мы постоянно анализируем тридцать червей одного генотипа для каждой репликации. Мы также осуществляем по крайней мере три повторяет для каждого эксперимента. Опытный экспериментатор должен иметь возможность анализировать не менее трех штаммов одновременно. Тем не менее, частота и интенсивность PTZ-индуцированные судороги обычно пик 15-30 минут воздействия, а затем затухают, как черви стали парализованными или, в некоторых случаях, акклиматизироваться к препарату.
- Посчитайте количество "эпилептического типа" конвульсиях червей каждые 30 минут в общей сложности один час. Лучше всего, чтобы оценка количества червей с передней судороги, которые мы называем "голова качается", отдельно от количества червей с полным тело конвульсии, полный паралич тела, которую мы называем "тоник", или сочетание передняя судороги с BWM паралич, который мы называем "тонико-клонические". Большинство червей одного генотипа проявляют лишь один вид судорог. Тем не менее, тонико-клонические черви зачастую становятся полностью тоник, поэтому следует продолжать анализ последних 30 минут, даже если все черви уже выставлены судороги. Кроме того, стоит отметить, что некоторые черви могут попытаться ползти от пластины. В этом случае экспериментатор может распространиться последовательной количество пальмитиновая кислота вокруг пластин PTZ. Выкладываем 25 мкл 10 мг пальмитиновая кислота / мл этанола.
Поведенческие реакции Выбранный C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи в альдикарб и PTZ
| Мутант Имя | Роль Synaptic | Поведение без наркотиков | Поведенческий ответ на альдикарб (по сравнению с диким типом N2) | Поведенческий ответ на PTZ |
|---|---|---|---|---|
| Том-1 (ok188) | тормозит синаптическую передачу | несогласованный | увеличенной скоростью паралича | неотличимы от дикого типа |
| UNC-43 (n498n1186) | комплекс | несогласованный | увеличенной скоростью паралича | все тело конвульсии |
| UNC-25 (e156) | ГАМК способствует передаче | несогласованный | увеличенной скоростью паралича | передняя судороги, все тело паралич |
| СНБ-1 (md247) | способствует синаптической передачи | несогласованный | сниженной ставке паралич | передняя судороги |
| UNC-4 (E120) | способствует передаче АЧ | несогласованный | сниженной ставке паралич | неотличимы от дикого типа |
Два нейронных стимуляторов, ингибиторов ацетилхолинэстеразы, называемый алдикарб, и антагонист рецепторов ГАМК, называемый pentylenetetrazole (PTZ), могут быть использованы на основе взаимодополняемости, чтобы охарактеризовать C. Элеганс синаптической передачи мутантов. Превышение возбуждающие ацетилхолина (АХ) накапливается в теле червя стену нервно-мышечного соединения (NMJs) от вредных мутаций в негативных регуляторов АЧ передачи (например, том-1 и UNC-43) или положительный регуляторы тормозных ГАМК-передачи (например, UNC-25). С другой стороны, возбуждающие уровни ацетилхолина на червя NMJs уменьшаются на вредных мутаций в положительной регуляторы общей синаптической передачи (например, SNB-1) или АЧ-специфических генов передачи (например, UNC-4). По сравнению с диким типом червей N2, червей мутантов с повышенной передачи возбуждающих АЧ на NMJs обладают повышенной скорости альдикарб вызванного параличом, в то время как черви мутанта с пониженной передаче возбуждающих АЧ демонстрируют снижение темпов альдикарб вызванного параличом. Хотя PTZ нарушает нейронные синхронность в Элеганс C. мышцах стенки тела, а не в отличие от алдикарб, PTZ также противодействует тормозных ГАМК в мышцах C. Элеганс голову. В результате, альдикарб чувствительность не может точно предсказать PTZ чувствительности. Мутант червей с конкретными дефектами в отрицательной или положительной RegulЭйшен передачи АЧ неотличимы от дикого типа N2 червей в присутствии PTZ, в то время как мутант червей с дефектами в положительной регуляции общего синаптической передачи или конкретных дефектов в тормозной ГАМК выставку передачи надежной PTZ-индуцированной передней судороги. Более того, UNC-43 с потерей функции мутантов отображения всего тела судороги в присутствии PTZ и, вероятно, имеют дополнительные нарушения синаптической передачи, которые способствуют их уникальных ответов препарата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Действующие протоколы по альдикарб экспозиции с C. Элеганс не позволяют экспериментаторам различать мутанты с конкретными дефицита ацетилхолина передачи и мутанты с обобщенными дефицит в синаптической передаче, так как оба класса мутантов выставку сопротивление альдикарб. Кроме того, алдикарб не может быть использована для определения того, мутанты имеют специфические дефициты ГАМК передачи или обобщенных неудачи негативно регулируют АЧ передачи, так как оба класса мутантов выставку повышенная чувствительность к альдикарб. Результаты наших анализов PTZ экспозиции, в сочетании с результатами анализов альдикарб экспозиции, позволяет исследователям лучше характеризуют синаптической передачи мутантов.
C. Элеганс синаптической передачи мутанты могут быть отнесены к простым способом дополнительными альдикарб и парадигмы PTZ экспозиции. Альдикарб устойчивых мутантов с PTZ-индуцированной передней судороги, вероятно, недостаточно в общем синаптической функции. И наоборот, альдикарб устойчивых мутантов без PTZ-индуцированной передней судороги, вероятно, специально дефицит ацетилхолина передачи. Мутанты с альдикарб гиперчувствительности, которые не проявляют PTZ-индуцированной передней судороги, вероятно, не в состоянии регулировать негативно АЧ передачи. Наконец, мутанты с альдикарб гиперчувствительности, которые делают выставку PTZ-индуцированной передней конвульсии, скорее всего ГАМК недостаточно.
Утилита воздействия альдикарб ослабляется его субъективность, так как различные экспериментаторы часто имеют различные определения паралич. Техника одного экспериментатора также может колебаться. Кроме того, алдикарб, подвергшихся воздействию червей двигаться по-разному в ответ на разнообразные силами подталкивать. Различие между парализованной червя и реагировать червя может быть столь же тонким, как небольшая голова и хвост дергаться. В дополнение к дополняющие альдикарб анализы для лучшей характеристикой С. Элеганс синаптической передачи мутантов, PTZ также может быть использован для выделения синаптических мутантов передачи, особенно мутантов с повышенной чувствительностью к альдикарб. Экспериментаторы, которые используют PTZ экспозиции, может просто искать передней судороги, а не тонкие различия в альдикарб вызванного параличом.>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотим отметить дух сотрудничества всех членов Колдуэлл Lab. Василий О'Коннор ученый награду от марте Dimes и КАРЬЕРА награду от Национального научного фонда в GAC, а также Бакалавриат Научные исследования грантовой программы из Медицинского института Говарда Хьюза в университете штата Алабама, финансировали нейронную возбудимость и эпилепсии исследований в Лаборатории Колдуэлл.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
