Summary
Denna video visar hur du anställa två neurala stimulantia, aldikarb och pentylenetetrazol (PTZ), kompletterande sätt att studera synaptisk funktion i nematoden, C. elegans. Det komplementära tillvägagångssättet kan också användas för att belysa evolutionärt bevarat mekanismer för modulerande neuronala synkroni och har betydelse för epilepsi och kramper.
Abstract
Den nematod, Caenorhabditis elegans, har blivit ett ändamålsenligt modell för att studera neurotransmission. C. elegans är unik bland djurmodeller, som anatomi och anslutning av sitt nervsystem har fastställts från elektron micrographs och förfinats med hjälp av farmakologiska analyser. I denna video beskriver vi hur två kompletterande neurala stimulantia, en acetylkolinesterashämmare, kallad aldikarb och en gammaaminosmörsyra (GABA) receptorantagonist, som kallas pentylenetetrazol (PTZ) kan användas för att specifikt karaktärisera signalering i C. elegans neuromuskulära korsningar (NMJs) och underlätta vår förståelse av antagonistiska neurala kretsar.
Av 302 C. elegans nervceller, nitton GABAergic D-typ motoriska nervceller innerverar kroppen väggen muskler (BWMs), medan fyra GABAergic nervceller, som kallas RMEs, innerverar huvudet muskler. Omvänt 39 motoriska nervceller uttrycka den excitatoriska neurotransmittorn, acetylkolin (ACh) och motverka GABA överföring på BWMs att samordna förflyttning. Den antagonistiska karaktären av GABAergic och kolinerga motoriska nervceller i kroppen väggen NMJs ursprungligen fastställdes med laser ablation och senare understödda av aldikarb exponering. Akut aldikarb exponering resulterar i en tid-kurs eller dos-lyhörd förlamning i vildtyp maskar. Ändå ger förlust av excitatoriska ACh överföring motstånd mot aldikarb, som mindre ACh ackumuleras på mask NMJs, vilket leder till mindre stimulering av BWMs. Resistens mot aldikarb kan ses med ACH-specifik eller allmän synapsfunktionen mutanter. I överensstämmelse med antagonistiska GABA och ACH överföring, förlust av GABA överföring, eller underlåtenhet att negativ reglera ACh versionen ger överkänslighet mot aldikarb. Även aldikarb exponering har lett till isolering av många masken homologer av neurotransmission gener, aldikarb exponering inte ensam kan effektivt avgöra rådande roller för gener och vägar i specifika C. elegans motoriska nervceller. För detta ändamål har vi infört en kompletterande experimentell metod, som använder PTZ.
Neurotransmission mutanter uppvisar tydliga fenotyper, till skillnad från aldikarb-inducerad förlamning, som svar på PTZ. Vildtyp maskar, liksom mutanter med specifika oförmåga att frigöra eller ta emot Ach, visar inte uppenbar känslighet för PTZ. Men GABA mutanter, samt allmän synaptisk mutanter funktion, visa främre kramper i en tid-kurs eller dos-lyhörd sätt. Mutanter som inte kan negativt reglerar generella neurotransmittor utsläpp och därmed utsöndrar stora mängder ACh på BWMs, blivit förlamad på PTZ. PTZ-inducerad fenotyper av diskreta mutant klasser visar att ett komplement med aldikarb och PTZ paradigm exponering i C. elegans kan accelerera vår förståelse av neurotransmission. Dessutom bör videor som visar hur vi presterar farmakologiska analyser fastställa enhetliga metoder för C. elegans forskning.
Protocol
Aldikarb Exponering Paradigm
- På den första dagen, se till att minst trettio unga vuxna stadiet maskar av varje genotyp och varje replikat kommer att finnas för aldikarb analyser på den andra dagen. Det bästa är om en försöksledaren väljer femtio eller fler L4-stadium maskar på färska NGM plattor (bäst utan nystatin), som innehåller E. coli (helst OP50) som en näringskälla, och odla dem för 12-24 timmar på ett konsekvent och tillåtande temperatur (20 ° C till 22 ° C är bäst, även om 25 ° C är okej).
- Den andra dagen, göra en 100-lösning mM lager av aldikarb med 70% etanol (EtOH) och 30% DDH 2 O. Sprid lämplig mängd aldikarb på NGM minus nystatin tallrikar med definierade volymer för att uppnå önskad aldikarb koncentrationer. Vi använder genomgående 0,5 mM aldikarb med plätering 37,5 mikroliter av 100 mm aldikarb på 7,5 ml NGM plattor. Låt aldikarb plattorna torka i ca 30-60 minuter i rumstemperatur. Det är inte nödvändigt att knäcka locken. Alternativt kan aldikarb läggas till NGM och lagras vid 4 ° C i en vecka.
- Efter torkning, tallrik konsekvent volymer av E. coli (helst OP50) på mitten av varje aldikarb plattan och torka i ytterligare 30-60 minuter i rumstemperatur. Vi tallrik consistently 25 mikroliter av OP50, vilket skapar en tillräcklig storlek mat gräsmattan för att hålla maskar koncentrerade till en liten plats utan trängsel.
- När maten gräsmattan är torr, kan man fortsätta med aldikarb analyser. På grund av den subjektiva natur aldikarb analyser, är det starkt rekommenderat att experiment utföras "blint". En kollega till den primära försöksledaren skulle märka om de ursprungliga registreringsskyltarna med maskar som ska analyseras. Likaså skulle kollega överföra maskar från de ursprungliga registreringsskyltarna till chiffrerat aldikarb plattor omedelbart innan du startar en timer. Om försöksledaren förväntar testmetoder för en viss stam av maskar med en karakteristisk fenotyp, som uncoordination, då måste det också finnas en kontroll med en liknande fenotyp för att minska bias. Dessutom är det bäst om försöksledaren analyserna en vild typ stam, såväl som en resistent stam och en överkänslig stam, parallellt för att hjälpa standardisera experiment. Försöksledaren bör sträva efter att analysera ett konsekvent antal maskar för varje replikera. Vi analyserar ständigt thirty maskar av en enda genotyp för varje replikera. Vi utför även minst tre replikat för varje experiment. En erfaren försöksledaren ska kunna analysera minst sex stammar samtidigt.
- Räkna antalet förlamad maskar som petade på ett enhetligt sätt varje mask med en platina tråd. Vi prod konsekvent våra maskar två gånger på huvudet och två gånger på svansen var 30 minuter för totalt tre timmar. Upphörande av svalget pumpa kan också användas för att definiera förlamning, men bara om försöksledaren sysselsätter en enhetlig definition av förlamning över alla analyser. Det är också värt att notera att en del maskar, särskilt de som är resistenta mot aldikarb, kan försöka krypa bort plattan. I detta fall kan försöksledaren sprida ett konsekvent mängd palmitinsyra, ett fysiskt hinder för mask förflyttning, runt aldikarb plattorna. Vi sprider 25 mikroliter 10 mg palmitinsyra / ml EtOH.
PTZ Exponering Paradigm
- På den första dagen, se till att minst trettio unga vuxna stadiet maskar av varje genotyp och varje replikat kommer att finnas tillgänglig för PTZ analyser på den andra dagen. Det bästa är om en försöksledaren väljer femtio eller fler L4-stadium maskar på färska NGM plattor (bäst utan nystatin), som innehåller E. coli (helst OP50) som en näringskälla, och odla dem för 12-24 timmar på ett konsekvent och tillåtande temperatur (20 ° C till 22 ° C är bäst, även om 25 ° C är okej).
- Den andra dagen, gör en 0,5 g PTZ / ml DDH 2 O stamlösning av PTZ. Sprid lämplig mängd PTZ på NGM minus tallrikar nystatin med definierade volymer för att uppnå önskad PTZ koncentrationer. Eftersom vi föredrar dos-respons-analyser för PTZ, vi tallrik varierande mängder PTZ på 7,5 ml NGM plattor. Till exempel kan man tallrik 37,5 mikroliter av PTZ-stamlösningen till en 7,5 ml NGM plattan för att göra en 5 mg PTZ / ml. Låt PTZ plattorna torka i ca 60-120 minuter vid rumstemperatur. Det är inte nödvändigt att knäcka locken. Alternativt kan PTZ läggas direkt till NGM, men det bör omedelbart användas för analyser efter stelnar. Stabiliteten i PTZ är betydligt mindre än aldikarb. Därför analyser med äldre PTZ-plattorna är mindre tillförlitliga. PTZ bör förvaras vid -20 ° C i en exsickator med ett torkmedel före användning. Vi föredrar att göra sig PTZ ungefär två månader efter öppnandet för att garantera stabilitet.
- Efter torkning, tallrik konsekvent volymer av E. coli (helst OP50)på mitten av varje PTZ plattan och torka i ytterligare 30-60 minuter i rumstemperatur. Vi tallrik consistently 25 mikroliter av OP50, vilket skapar en tillräcklig storlek mat gräsmattan för att hålla maskar koncentrerade till en liten plats utan trängsel.
- När maten gräsmattan är torr, kan man fortsätta med PTZ-analyser. Även PTZ-analyser är mindre subjektiva än aldikarb analyser, är det fortfarande starkt rekommenderat att experiment utföras "blint". En kollega till den primära försöksledaren skulle märka om de ursprungliga registreringsskyltarna med maskar som ska analyseras. Likaså skulle kollega överföra maskar från de ursprungliga registreringsskyltarna till chiffrerat PTZ plattor omedelbart innan du startar en timer. Om försöksledaren förväntar testmetoder för en viss stam av maskar med en karakteristisk fenotyp, som uncoordination, då måste det också finnas en kontroll med en liknande fenotyp för att minska bias. Dessutom är det bäst om försöksledaren analyserna en vild typ stam, samt stammar med främre eller hela kroppen kramper, parallellt för att hjälpa standardisera experiment. Försöksledaren bör sträva efter att analysera ett konsekvent antal maskar för varje replikera. Vi analyserar ständigt thirty maskar av en enda genotyp för varje replikera. Vi utför även minst tre replikat för varje experiment. En erfaren försöksledaren ska kunna analysera minst tre stammar samtidigt. Men frekvensen och intensiteten av PTZ-inducerade kramper oftast topp mellan 15-30 minuter av exponering, och sedan dämpa som maskar blivit förlamade eller, i vissa fall anpassa sig till drogen.
- Räkna antalet "epileptiska-liknande" kramper maskar var 30 minuter för totalt en timme. Det är bäst att göra poäng antalet maskar med främre konvulsioner, som vi kallar "head-bobs", separat från antalet maskar med hela kroppen kramper, hela kroppen förlamning, som vi kallar "tonic", eller en kombination av främre Kramper med BWM förlamning, som vi kallar "tonisk-kloniska". De flesta maskar av en enda genotyp uppvisar endast en typ av krampanfall. Men tonisk-kloniska maskar blir ofta helt tonic, så man bör fortsätta analysen senaste 30 minuter, även om alla maskar har redan ställt ut kramper. Det är också värt att notera att vissa maskar kan försöka krypa bort plattan. I detta fall kan försöksledaren sprida ett konsekvent mängd palmitinsyra runt PTZ-plattorna. Vi sprider 25 mikroliter 10 mg palmitinsyra / ml EtOH.
Beteendemässiga reaktioner av utvalda C. elegans synaptisk transmission Mutants till Aldikarb och PTZ
| Mutant Namn | Synaptic roll | Beteenden utan Drug | Behavioral Svar på Aldikarb (jämfört med vildtyp-N2) | Behavioral Svar på PTZ |
|---|---|---|---|---|
| tom-1 (ok188) | hämmar synaptisk transmission | okoordinerade | ökad takt av förlamning | skiljas från vildtyp |
| UNC-43 (n498n1186) | komplexa | okoordinerade | ökad takt av förlamning | hela kroppen kramper |
| UNC-25 (e156) | främjar GABA överföring | okoordinerade | ökad takt av förlamning | främre kramper, hela kroppen förlamning |
| SNB-1 (md247) | främjar synaptisk transmission | okoordinerade | reducerad av förlamning | främre kramper |
| UNC-4 (E120) | främjar ACh överföring | okoordinerade | reducerad av förlamning | skiljas från vildtyp |
Två neurala stimulantia, en acetylkolinesterashämmare, kallad aldikarb och en GABA-receptor antagonist, som kallas pentylenetetrazol (PTZ) kan användas på ett kompletterande sätt att karaktärisera C. elegans synaptisk transmission mutanter. Överskott excitatoriska acetylkolin (ACh) ackumuleras på masken kroppen vägg neuromuskulära korsningar (NMJs) från skadliga mutationer i negativa regulatorer av ACh överföring (t ex tom-1 och UNC-43) eller positiva regulatorer av inhibitoriska GABA överföring (t.ex. UNC-25). Omvänt är excitatoriska ACh nivåer masken NMJs minskat med skadliga mutationer i positiva regulatorer av allmänt synaptisk transmission (t.ex. SNB-1) eller ACH-specifika gener transmission (t.ex. UNC-4). Jämfört med vildtyp-N2 maskar, muterade maskar med förhöjd excitatoriska ACh överföring vid NMJs uppvisar Högre aldikarb-inducerad förlamning, medan mutant maskar med sänkt excitatoriska ACh överföring visa sänkta aldikarb-inducerad förlamning. Även PTZ stör neuronala synkront med C. elegans muskler kropp väggen, inte olikt aldikarb, motverkar PTZ också inhibitoriska GABA i C. elegans huvudet muskler. Som ett resultat kan aldikarb känslighet inte exakt förutsäga PTZ känslighet. Mutant maskar med specifika defekter i negativ eller positiv Regulring av ACh överföring inte kan skiljas från vildtyp N2 maskar i närvaro av PTZ, medan mutant maskar med defekter i positiv reglering av allmänna synaptisk överföring eller specifika defekter i inhibitoriska GABA överföring uppvisar robust PTZ-inducerad anterior kramper. Dessutom UNC-43 bortfall av funktionen mutanter uppvisar hela kroppen konvulsioner i närvaro av PTZ och sannolikt har ytterligare synaptisk transmission avvikelser, som bidrar till deras unika läkemedlet svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aktuella protokoll för aldikarb exponering med C. elegans tillåter inte praktiker att skilja mellan mutanter med specifika brister i ACh överföring och mutanter med generaliserad underskott i synaptisk transmission, eftersom båda klasserna av mutanter uppvisar resistens mot aldikarb. På samma sätt kan aldikarb inte användas för att avgöra om mutanter har specifika brister i GABA överföring eller generaliserad fel att negativt reglera ACh överföring, eftersom båda klasserna av mutanter uppvisar överkänslighet mot aldikarb. Resultat från våra PTZ exponering analyser i kombination med resultat från aldikarb exponering analyser, ger forskare möjlighet att bättre karaktärisera synaptisk transmission mutanter.
C. elegans synaptisk transmission mutanter kan klassificeras på ett enkelt sätt genom kompletterande aldikarb och PTZ paradigm exponering. Aldikarb resistenta mutanter med PTZ-inducerad anterior kramper sannolikt brister i allmänhet synaptisk funktion. Omvänt aldikarb resistenta mutanter utan PTZ-inducerad anterior kramper sannolikt speciellt brist på ACh överföring. Mutanter med aldikarb överkänslighet, som inte uppvisar PTZ-inducerad anterior kramper, sannolikt inte negativt reglera ACh överföring. Slutligen, mutanter med aldikarb överkänslighet, som inte uppvisar PTZ-inducerad anterior kramper, sannolikt GABA bristfällig.
Nyttan av aldikarb exponering är också försvagas av sin subjektivitet, eftersom olika praktiker ofta har olika definitioner av förlamning. En enda försöksledaren s teknik kan också variera. Även aldikarb exponerade maskar gå annorlunda till följd av olika krafter petade. Skillnaden mellan en förlamad mask och en lyhörd mask kan vara så subtila som en liten huvud eller svans rycka. Förutom att komplettera aldikarb analyser för bättre karakterisering av C. elegans synaptisk transmission mutanter kan PTZ också användas för att isolera synaptisk transmission mutanter, särskilt de mutanter som är överkänsliga mot aldikarb. Praktiker, som utnyttjar PTZ exponering, kan helt enkelt leta efter främre kramper, istället för subtila skillnader i aldikarb-inducerad förlamning.>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill erkänna den kooperativa andan i alla Caldwell Lab medlemmar. En Basil O'Connor Scholar Award från March of Dimes och en karriär utmärkelse från National Science Foundation för att GAC, samt en Grundutbildning Forskning Science Program Bidrag från Howard Hughes Medical Institute på University of Alabama, har finansierat neuronala retbarhet och epilepsi forskning i Caldwell Lab.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
