Summary
Bu video iki sinir uyarıcı, aldicarb ve pentylenetetrazole (PTZ), nematod, C. elegans sinaptik fonksiyonu çalışma tamamlayıcı yollardan nasıl istihdam göstermektedir. Bu modüle nöronal senkronizasyonu için evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları tamamlayıcı bir yaklaşım da ışık tutmak için kullanılan ve epilepsi ve nöbet etkileri olabilir.
Abstract
Caenorhabditis elegans, nematod, nörotransmisyon çalışmak için bir çare bir model haline gelmiştir. Sinir sistemi anatomisi ve bağlantı elektron mikrograflar belirlenir ve farmakolojik testlerin rafine olarak C. elegans, hayvan modelleri arasında eşsizdir. Bu video, özellikle C. elegans nöromüsküler kavşaklarda sinyalizasyon karakterize pentylenetetrazole (PTZ) olarak adlandırılan iki tamamlayıcı sinir uyarıcı, aldicarb denilen bir asetilkolinesteraz inhibitörü ve bir gama-amino butirik asit (GABA) reseptör antagonisti, istihdam nasıl tarif (NMJs) ve antagonist nöral devrelerin anlaşılmasını kolaylaştırmak.
302 C. elegans nöronlar, ondokuz GABAerjik D-tipi motor nöronlar innerve vücut duvarı kasları (BWMs), Of iken RMEs adlı dört GABAerjik nöronlar, innerve baş kasları. Tersine, otuz dokuz motor nöronların asetilkolin eksitatör nörotransmitter ifade (ACh) ve GABA iletim lokomosyon koordine etmek BWMs antagonize. Vücut duvarı NMJs GABAerjik ve kolinerjik motor nöronların antagonistik doğa başlangıçta lazer ablasyon tarafından belirlenir ve daha sonra aldicarb maruz tarafından desteklenebilir. Yabani tip solucanlar bir zaman kurs veya doz-yanıt felç Akut aldicarb pozlama sonuçları. Ancak, daha az ACh, solucan NMJs birikir gibi eksitatör ACh iletim kaybı, BWMs az stimülasyonuna yol, aldicarb direnç bahşeder. ACh özel veya genel sinaptik fonksiyon mutantlar aldicarb için direnç görülebilir. GABA antagonistik ve ACh şanzıman, GABA iletim kaybı ya da olumsuz ACh serbest düzenlemek için bir başarısızlık ile tutarlı, aldicarb aşırı duyarlılık bahşeder. Aldicarb maruz aldicarb maruz kalma, çok sayıda solucan homologları nörotransmisyon genlerin izolasyonu yol olmasına rağmen, tek başına verimli özel C. elegans motor nöronların genler ve yollar için geçerli olan rolleri tespit edemez. Bu amaçla, tamamlayıcı bir deneysel yaklaşım, PTZ kullanır girmiştik.
Nörotransmisyon mutantlar PTZ yanıt aldicarb-kaynaklı felç farklı açık fenotipleri, gösterir. Wild-tip solucanların yanı sıra, ACh salınımı veya almak için özel Yetersizliklerimizle ile mutantlar, PTZ için belirgin hassasiyet görünmüyor. Bununla birlikte, GABA mutantlar yanı sıra genel sinaptik fonksiyon mutant zaman kurs veya doz duyarlı bir şekilde ön konvülsiyonlar. Genel nörotransmitter serbest olumsuz düzenleyen ve böylece, Mutants PTZ üzerinde felç haline BWMs üzerine ACh aşırı miktarda salgılar. Ayrık mutant sınıfların PTZ ile indüklenen fenotipleri C. elegans aldicarb ve PTZ maruz paradigmalar ile tamamlayıcı bir yaklaşım nörotransmisyon anlayışımız hızlandırmak olduğunu göstermektedir. Ayrıca, biz farmakolojik testlerin nasıl performans gösteren videolar C. elegans araştırma için tutarlı yöntemler oluşturmalıdır.
Protocol
Aldicarb Pozlama paradigması
- İlk gün, her genotip ve her çoğaltmak en az otuz genç yetişkin aşamada solucanlar aldicarb testlerin ikinci gününde kullanılabilir olmasını sağlamak. E. içeren taze NGM plakalar üzerine elli veya daha fazla L4 aşamada solucanlar (en iyi nystatin olmadan), bir deneyci seçerse en iyisidir bir besin kaynağı olarak coli (tercihen OP50), tutarlı ve müsamahakar sıcaklığında (20 ° C - 22 ° C 25 ° C tamam olmasına rağmen, en iyi), 12-24 saat boyunca onları büyümeye
- Ikinci gününde,% 70 etanol (EtOH) ve% 30 GKD 2 O. aldicarb 100 mM stok solüsyonu Istenen aldicarb konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda aldicarb tanımlanan hacimli NGM eksi nistatin plakalar üzerine sürün. Biz sürekli olarak 7.5 ml NGM plakalar üzerine kaplama ile 100 mM aldicarb 37.5 mcL 0.5 mM aldicarb kullanabilirsiniz. Aldicarb plakaları oda sıcaklığında yaklaşık 30-60 dakika kurumasını bekleyin. Bu kapaklar çatlak için gerekli değildir. Alternatif olarak, aldicarb NGM eklendi ve 4 ° C de bir hafta boyunca saklanan olabilir.
- E. kurutma, plaka tutarlı hacimleri sonra Her aldicarb plaka merkezi ve başka bir 30-60 dakika oda sıcaklığında kuru üzerine coli (tercihen OP50). Biz sürekli aşırı kalabalık olmayan, küçük bir noktada yoğunlaşmış solucanlar tutmak için yeterli büyüklükte bir gıda çim oluşturur plaka OP50 25 mcL.
- Gıda çim kuru olduğunda, bir aldicarb deneyleri ile devam edebilir. Aldicarb deneyleri öznel doğası nedeniyle, son derece deneyleri "körü körüne" yapılması tavsiye edilir. Birincil deneyci bir meslektaşım çalışılmalıdır solucanlar orijinal plakaları yeniden-etiket. Aynı şekilde, iş arkadaşı, bir zamanlayıcı başlamadan hemen önce, orijinal plakalardan şifreli aldicarb plakaları solucanlar transfer olabilir. Deneyci solucanlar gibi uncoordination gibi karakteristik bir fenotip, belirli bir gerginlik assaying öngörüyor, sonra da orada yanlılığı azaltmak için benzer bir fenotip bir kontrol edilmelidir. Dahası, deneyci deneyleri deneyler standardize yardımcı paralel yabani tip bir gerginlik yanı sıra dirençli ve aşırı duyarlı bir gerginlik, eğer en iyisidir. Deneyci solucanlar her çoğaltmak için tutarlı bir analiz etmek için gayret göstermelisiniz. Biz sürekli olarak her çoğaltmak için tek bir genotip otuz solucanlar analiz eder. Biz de en az üç gerçekleştirin her bir deney için çoğaltır. Deneyimli bir deneyci bir defada en az altı suşları analiz etmek gerekir.
- Tutarlı bir şekilde dürtüsüyle bir platin tel ile her solucan felç solucanlar sayısını. Biz iki kez baş ve kuyruk üç saat olmak üzere toplam her 30 dakikada iki kez sürekli solucanlar eşya. Faringeal pompalama durması da deneyci, tüm çalışmalar boyunca felç tutarlı bir tanım istihdam sadece felç tanımlamak için kullanılır, ama olabilir. Ayrıca, özellikle bazı solucanlar, aldicarb karşı dayanıklı bu plaka tarama deneyebilir fazlalaştı. Bu durumda, deneyci aldicarb plakaların etrafında, palmitik asit, solucan lokomosyon fiziksel bir bariyer tutarlı bir miktarda yayılabilir. Biz 10 mg palmitik asit / ml EtOH 25 mcL yayıldı.
PTZ Pozlama Paradigma
- İlk gün, her genotip ve her çoğaltmak en az otuz genç yetişkin aşamada solucanlar ikinci gününde PTZ testleri için kullanılabilir olmasını sağlamak. E. içeren taze NGM plakalar üzerine elli veya daha fazla L4 aşamada solucanlar (en iyi nystatin olmadan), bir deneyci seçerse en iyisidir bir besin kaynağı olarak coli (tercihen OP50), tutarlı ve müsamahakar sıcaklığında (20 ° C - 22 ° C 25 ° C tamam olmasına rağmen, en iyi), 12-24 saat boyunca onları büyümeye
- Ikinci gününde, PTZ 0.5 g PTZ / ml GKD 2 O stok solüsyonu olun. PTZ uygun miktarda, istenilen PTZ konsantrasyonları elde etmek için tanımlanmış hacimli NGM eksi nistatin plakalar üzerine sürün. PTZ için doz-yanıt deneyleri tercih Çünkü plaka 7.5 mL NGM plakalar üzerine PTZ değişen miktarlarda. Örneğin, bir plaka PTZ stok solüsyonu 7.5 ml NGM tabağa mcL 37.5, 5 mg PTZ / ml çözüm haline getirmektedir. PTZ plakaları oda sıcaklığında yaklaşık 60-120 dakika kurumasını bekleyin. Bu kapaklar çatlak için gerekli değildir. Alternatif olarak, PTZ NGM direkt olarak ilave edilebilir, ancak hemen katılaşmadan sonra deneyleri için kullanılmalıdır. PTZ istikrarı aldicarb bu çok daha az. Bu nedenle, eski PTZ plakaları ile testlerin daha az güvenilir. PTZ kullanmadan önce kurutucu bir desikatöre -20 ° C'de muhafaza edilmelidir. Biz istikrarı sağlamak için açtıktan sonra yaklaşık iki ay PTZ atmak için tercih ediyor.
- E. kurutma, plaka tutarlı hacimleri sonra coli (tercihen OP50)Her PTZ plaka ve başka bir 30-60 dakika oda sıcaklığında kuru merkezi üzerine. Biz sürekli aşırı kalabalık olmayan, küçük bir noktada yoğunlaşmış solucanlar tutmak için yeterli büyüklükte bir gıda çim oluşturur plaka OP50 25 mcL.
- Gıda çim kuru olduğunda, bir PTZ testleri devam edebilir. PTZ testleri aldicarb testleri daha az öznel olmakla birlikte, hala çok deneyleri "körü körüne" yapılması tavsiye edilir. Birincil deneyci bir meslektaşım çalışılmalıdır solucanlar orijinal plakaları yeniden-etiket. Aynı şekilde, iş arkadaşı, bir zamanlayıcı başlamadan hemen önce orijinal plakalardan şifrelenmiştir PTZ plakaları solucanlar transfer olabilir. Deneyci solucanlar gibi uncoordination gibi karakteristik bir fenotip, belirli bir gerginlik assaying öngörüyor, sonra da orada yanlılığı azaltmak için benzer bir fenotip bir kontrol edilmelidir. Ayrıca, deneyci deneyleri deneyler standardize yardımcı paralel ön veya tam vücut konvülsiyonlar ile yabani tip gerginlik yanı sıra suşları, eğer iyi olur. Deneyci solucanlar her çoğaltmak için tutarlı bir analiz etmek için gayret göstermelisiniz. Biz sürekli olarak her çoğaltmak için tek bir genotip otuz solucanlar analiz eder. Biz de en az üç gerçekleştirin her bir deney için çoğaltır. Deneyimli bir deneyci bir defada en az üç tür analiz etmek gerekir. Ancak, solucanlar ilaç gelmesini felç olmak veya bazı durumlarda, PTZ ile indüklenen maruz kalma 15-30 dakika arasında genellikle tepe konvülsiyonlar ve sıklığını ve şiddetini zayıflatmak.
- Toplam bir saatlik bir "sara gibi" solucanlar çırpınan her 30 dakika sayısını. Solucanlar sayısı tam vücut konvülsiyonlar, tam vücut felç, "tonik" diyoruz, ya da bir kombinasyonu ile ayrı ayrı "kafa kafaya bobs" diyoruz ön konvülsiyonlar, solucanlar sayısını skor iyi , "tonik-klonik" diyoruz BWM felç anterior konvülsiyonlar,. Çoğu tek bir genotip solucanlar konvülsiyon sadece bir tür sergiler. Ancak, tonik-klonik solucanlar genellikle tamamen tonik, bu yüzden tüm solucanlar zaten konvülsiyonlar sergilenmektedir olsa bile bir 30 dakika geçmiş tahlil devam etmelidir. Ayrıca, bazı solucanlar plaka tarama deneyebilir fazlalaştı. Bu durumda, deneyci tutarlı bir PTZ plakaların etrafında palmitik asit miktarı yayılabilir. Biz 10 mg palmitik asit / ml EtOH 25 mcL yayıldı.
Aldicarb ve PTZ Seçilmiş C. elegans Sinaptik İletim Mutants Davranış Yanıtları
| Mutant Adı | Synaptic Rolü | İlaç olmayan davranışı | Aldicarb Davranış Tepki (yabani tip N2 göre) | PTZ için Davranışsal Tepki |
|---|---|---|---|---|
| tom-1 (ok188) | sinaptik iletim inhibe | koordinasyonsuz | gelişmiş felç oranı | wild-tip ayırt edilemez |
| unc-43 (n498n1186) | karmaşık | koordinasyonsuz | gelişmiş felç oranı | tam vücut konvülsiyonlar |
| unc-25 (e156) | GABA iletim teşvik | koordinasyonsuz | gelişmiş felç oranı | ön konvülsiyonlar, tam vücut felci |
| SNB-1 (md247) | sinaptik iletim teşvik | koordinasyonsuz | felç düşük oranda | ön konvülsiyonlar |
| unc-4 (E120) | ACh iletim teşvik | koordinasyonsuz | felç düşük oranda | wild-tip ayırt edilemez |
Pentylenetetrazole (PTZ) olarak adlandırılan iki sinir uyarıcı aldicarb denilen bir asetilkolinesteraz inhibitörü ve GABA reseptör antagonisti, C. elegans sinaptik iletim mutantlar karakterize etmek için tamamlayıcı bir şekilde kullanılabilir. Aşırı eksitatör asetilkolin (Ach) solucan vücut duvarı nöromüsküler kavşaklar (NMJs) ACh iletim negatif düzenleyiciler zararlı mutasyonlar birikir (mesela tom-1 ve unc-43) veya inhibitör GABA şanzıman (örneğin, amc-25) pozitif düzenleyiciler. Tersine, solucan NMJs eksitatör ACh düzeyleri, zararlı mutasyonların genel sinaptik iletim (örneğin, SNB-1) veya ACh özel iletim genler (örneğin unc-4) pozitif düzenleyiciler azaldı. Alçaltılmış eksitatör ACh iletim mutant solucanlar aldicarb kaynaklı felç azalmış oranları göstermektedir ise yabani tip N2 solucanlar karşılaştırıldığında, NMJs yükseltilmiş eksitatör ACh şanzıman ile mutant solucanlar, aldicarb kaynaklı felç gelişmiş oranları sergilerler. PTZ, C. elegans vücut duvarı kasları aldicarb aksine nöronal senkronizasyonunu bozan rağmen, PTZ C. elegans baş kasları da inhibitör GABA antagonize. Sonuç olarak, aldicarb hassasiyet, PTZ hassasiyetini doğru tahmin edemez. Negatif ya da pozitif Regul özel kusurları olan Mutant solucanlarACh iletim ation PTZ varlığı yabani tip N2 solucanlar ayırt edilemez, inhibitör GABA iletim sergi sağlam PTZ ile indüklenen ön konvülsiyonlar genel sinaptik iletim ya da belirli kusurlar olumlu yönetmelikte kusurları ile mutant solucanlar ise. Ayrıca, PTZ varlığı unc-43-fonksiyon kaybı mutantlar tam vücut konvülsiyonlar görüntüler ve muhtemelen kendilerine özgü ilaç yanıtları katkıda bulunan ek sinaptik iletim anormallikleri var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C ile aldicarb maruziyet için mevcut protokoller elegans mutantlar iki sınıfları aldicarb direnç gösterirler deneyciler, sinaptik iletim genelleştirilmiş açıkları ile ACh iletim ve mutantlar belirli eksiklikler ile mutantlar arasında ayrım izin vermez. Aynı şekilde, aldicarb mutantlar iki sınıfları aldicarb aşırı duyarlılık sergileyen mutantlar olumsuz ACh iletim düzenleyen GABA iletim veya genelleştirilmiş hataları belirli eksiklikler varsa belirlemek için kullanılan olamaz. PTZ maruz deneyleri, aldicarb maruz testlerin sonuçları ile birlikte, elde edilen sonuçlar, araştırmacılar daha iyi sinaptik iletim mutantlar karakterize etmek için izin verir.
C. elegans sinaptik iletim mutantlar tamamlayıcı aldicarb ve PTZ maruz paradigmalar tarafından basit bir şekilde sınıflandırılabilir. PTZ ile indüklenen ön konvülsiyonlar Aldicarb dirençli mutantlar genel sinaptik fonksiyon muhtemelen eksiktir. Tersine, PTZ ile indüklenen ön konvülsiyonlar olmadan aldicarb dirençli mutantlar ACh şanzıman muhtemelen özellikle eksiktir. PTZ ile indüklenen ön konvülsiyonlar göstermezler aldicarb aşırı duyarlılık, Mutantlar, büyük olasılıkla olumsuz ACh iletim düzenlemek için başarısız olur. Son olarak, sergi PTZ ile indüklenen anterior konvülsiyonlar yapmak aldicarb aşırı duyarlılığı olan mutantlar, eksik muhtemelen GABA.
Aldicarb maruz kalma yardımcı programı da farklı deneyciler sık sık çeşitli tanımları felç gibi, öznellik zayıflar. Tek bir deneyci tekniği de dalgalanma. Ayrıca, aldicarb maruz kalan solucanlar dürtüsüyle, farklı güçlere karşı farklı hareket eder. Felçli bir solucan ve duyarlı bir solucanı arasındaki ayrım, hafif bir baş veya kuyruk seğirme gibi ince olabilir. C daha iyi karakterizasyonu için aldicarb testleri tamamlayan ek olarak elegans sinaptik iletim mutantlar, PTZ aldicarb karşı aşırı duyarlılık, özellikle sinaptik iletim mutantlar, bu mutantlar izole etmek için kullanılan olabilir . PTZ maruz kullanan deneyciler, sadece aldicarb kaynaklı felç ince farklar yerine, ön konvülsiyonlar için görünebilir.>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz tüm Caldwell Lab üyeleri işbirliği ruhu kabul etmek istiyoruz. Dimes, Mart ve Ulusal Bilim Vakfı GAC KARİYER Ödülü Basil O'Connor Scholar Ödülü yanı sıra, Alabama Üniversitesi ile Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Araştırma Lisans Programı Hibe, nöronal uyarılabilirliği ve finanse Caldwell Lab epilepsi araştırma.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
