ライブ固定化酵母細胞の可視化のための高速手法

Summary

ここにサイレント交配座HMLとHMRで蛍光レポーターに適用成長している固定化酵母細胞の可視化のための急速な技術、

Abstract

ここでは、落射蛍光顕微鏡による成長酵母細胞の固定化と可視化のための、シンプルで迅速な、そして非常に柔軟な手法を提示する。技術は均等に長さが10時間までの静的な酵母の集団、またはタイムコース実験の可視化に適しています。私の顕​​微鏡は、S. cerevisiaeのサイレント交配の遺伝子座で後成的遺伝を研究しています。それらはヘテロクロマチンにパッケージされていると正常に表現されていない2つのサイレント交配の遺伝子座、HMLとHMRは、あります。 SIR1変異体背景のサイレンシングに各遺伝子座表現または沈黙エピジェネティックな状態にすることができることなど弱体化されているので、全体として人口にHMLとHMRの両方のためのさまざまなエピジェネティックな状態の細胞の混在がある。私の顕​​微鏡は、個々のセル内のHMLとHMRのエピジェネティックな状態の間には関係がないことを示した。 SIR1細胞は確率的にエピジェネティックな状態は、以前に発現した遺伝子座のサイレンシングを確立したり、以前に沈黙軌跡を表現して切り替える。私の時間経過顕微鏡は、4つのエピジェネティックなスイッチのそれぞれの頻度、およびそのためSIR1細胞におけるエピジェネティックな状態のそれぞれの安定性を獲得するために、個々のSIR1細胞とその子孫を追跡した。 Xuらも参照してください。、モル。細胞2006。

Protocol

1. 時間の経過落射蛍光顕微鏡のための固定化細胞。顕微鏡の対物レンズが顕微鏡ステージの下にある場合は、このプロトコルにのみ、有効であることに注意してください。
   
   
2. 長いカバースリップ上に液体培地で所望の濃度で、場所細胞（およそ24x50mm）
   
   
3. 合成培地プレート（これらは低い自家蛍光を持っている）と細胞上の場所から目的のサイズの寒天ブロックをカット。細胞と接触してピンセットで処理されない寒天ブロックの側に置きます。
   
   
4. 短い時間のコース（最大3時間）の場合は、このセットは、最大で十分です。顕微鏡で可視化するときに細胞が移動している場合は、セルまたは寒天ブロックの増加領域の体積を減少させる。
   
   
5. 長い時間のコースの場合は、寒天ブロックの上に新鮮な液体培地のドロップを配置し、寒天ブロックの上にスライドガラスを配置。このスライドは、寒天ブロックの上部から蒸発が減少します。必要に応じて、カバースリップと接触寒天ブロックのエッジがさらに水分を減らすためにワセリンでシールすることができます。私は、野生型の速度で分裂する細胞で、長い9時間に映画のためにこのセットを使い切っている。

Discussion

これはまだ成長を可能にしながら酵母細胞を固定化する急速な技術です。我々は、酵母は、実験を通して、野生型の分裂速度を表示すると、最大10時間まで酵母の成長を続けている。このセットアップは、顕微鏡ステージの下に対物レンズが必要であることに注意してください。