Une technique rapide pour la visualisation de Live cellules de levure immobilisées

Summary

Une technique rapide pour la visualisation de la croissance des cellules de la levure immobilisée, ici appliqué à des journalistes fluorescentes au niveau des loci d'accouplement silencieuse HML et HMR

Abstract

Nous présentons ici une technique simple, rapide et extrêmement flexible pour l'immobilisation et la visualisation des cellules de levure de croissance par microscopie à épifluorescence. La technique est également adapté pour la visualisation des populations de levures statique, ou les cours d'expériences en temps jusqu'à dix heures. Mon microscope hérédité épigénétique étudie au niveau des loci d'accouplement silencieuse chez S. cerevisiae. Il ya deux loci d'accouplement silencieux, HML et HMR, qui ne sont normalement pas exprimée comme ils sont emballés dans l'hétérochromatine. Dans le contexte mutant sir1 taire est affaibli de telle sorte que chaque locus peut être soit dans l'état exprimés ou sous silence épigénétique, donc dans la population dans son ensemble il ya un mélange de cellules de différents états épigénétiques pour les deux HML et HMR. Mon microscope a démontré qu'il n'existe aucune relation entre l'état épigénétique des HML et HMR dans une cellule individuelle. sir1 cellules stochastiquement commuter les états épigénétiques, l'établissement de faire taire à un locus précédemment exprimées ou exprimant un lieu préalablement au silence. Mon microscope cours du temps suivis individuels sir1 cellules et de leur progéniture pour marquer la fréquence de chacun des quatre commutateurs possibles épigénétiques, et donc la stabilité de chacun des états épigénétiques dans les cellules sir1. Voir aussi Xu et al., Mol. Cellule 2006.

Protocol

1. Cellules immobilisées pour la microscopie à épifluorescence le temps bien sûr. S'il vous plaît noter que ce protocole n'est utile que si l'objectif de lentilles du microscope sont en dessous de la platine du microscope.
   
   
2. Cellules de lieu à la concentration voulue en milieu liquide sur une lamelle longue (environ 24x50mm)
   
   
3. Couper un bloc de gélose de la taille souhaitée à partir d'une plaque synthétique médias (ceux-ci ont moins d'autofluorescence) et les placer sur les cellules. Placez le côté du bloc d'agar ne sont pas manipulés par des pinces en contact avec les cellules.
   
   
4. Pour les cours du temps plus courts (jusqu'à 3 heures), cette mise en place est suffisante. Si les cellules sont en mouvement lorsque visualisés sur le microscope, diminution du volume de cellules ou de la zone augmentation du bloc de gélose.
   
   
5. Pour les cours de plus de temps, déposer une goutte de liquide sur Fresh Media sommet du bloc d'agar, et placer une lame de verre sur le dessus du bloc de gélose. Cette diapositive réduit l'évaporation par le haut du bloc de gélose. Si désiré, les bords du bloc de gélose en contact avec la lamelle peut être scellé avec de la vaseline pour réduire encore l'humidité. J'ai utilisé cette mise en place pour les films jusqu'à 9 heures, avec les cellules qui se divisent à un rythme de type sauvage.

Discussion

C'est une technique rapide qui immobilise les cellules de levure, tout en permettant la croissance. Nous avons suivi la croissance de la levure pour un maximum de dix heures, avec la levure affichage sauvage taux de division de type long de l'expérience. Notez que cette configuration nécessite l'objectif d'être en dessous de la platine du microscope.