Summary
显微镜观察药物敏感性（MODS）的检测方法是一种低成本，低技术含量的高性能的检测结核病（TB）和耐多药结核病（MDRTB）工具。本视频介绍MODS的液体培养基中培养方法。
Abstract
活动性肺结核患者（TB）的感染每年10-15其他人，使诊断活动性结核病，既治愈病人，并防止新的感染至关重要。此外，耐药结核病（MDRTB）的出现意味着停止耐药菌株的传播耐药性的检测是必要的。显微镜观察药物敏感性（MODS）的检测方法是一种低成本，低技术含量的高性能的检测结核病和MDRTB工具。结核分枝杆菌（MTB）的增长速度比2固体培养基上，在液体介质）微观山地车的增长可以被检测到，早在液体介质等待宏观固体培养基上菌落外观，并MODS的检测是基于三个原则：1）增长是MTB的特点，使得它从非典型分枝杆菌或真菌或细菌污染3）杰出的药物异烟肼和利福平可分为MODS的检测纳入到允许MDRTB同时直接检测，这样就不必为亚文化执行间接的药敏试验。痰涂片的灵敏度低，长期拖延，直到诊断与固体培养基培养，与现有的液体培养基中培养的方法，成本过高，而且需要做间接药敏试验检测MDRTB亚文化阻碍了竞争的目前诊断。的非专有MODS的方法相反，一个结核病和MDRTB高灵敏度，是一个较快的文化方法，同时药物易感性测试为MDRTB，只是根据美元的结核病测试3资源有限的环境和MDRTB。
Protocol
- 准备库存解决方案
- 磷酸盐缓冲库存
- 950毫升磷酸二氢钾解决方案（磷酸钾溶于千毫升蒸馏水二氢9.07克），搅拌混合950毫升钠磷酸氢二钠溶液（溶于千毫升蒸馏水磷酸钠二元9.47克）;保持每一个解决方案，回到50毫升调整如有必要的pH值
- 调节pH值至6.8 ± 0.2：添加钠磷酸氢二钠溶液，以提高pH值;添加磷酸二氢钾溶液，以较低的pH值
- 高压灭菌器在121-124 ° C下15分钟消毒
- 铠甲一个100μL分装在培养皿中，并培育营养琼脂培养基上的磷酸盐缓冲溶液，在37 ° C，48小时，以确认无菌
- 存放在冰箱中2-8℃长达一个月
注 ：每个痰标本需要磷酸盐缓冲液10毫升
- 去污股票
- 合并相同体积的氢氧化钠溶液（氢氧化钠溶解在200ml无菌蒸馏水8.0克）和柠檬酸钠溶液（柠檬酸钠在200ml无菌蒸馏水蒸馏水5.8克）
- 15分钟组合在121-124 ° C的反应釜
- 存放在冰箱中2-8℃长达一个月
注 ：每个痰标本需要净化股票2毫升
- 文化传媒股票
- 添加到无菌蒸馏水900毫升casitone和5.9克7H9培养基粉的甘油和1.25克3.1毫升;不断搅拌混合，直到完全溶解
- 15分钟在121-124 ° C的高压灭菌器
- 冷却和抗生素的解决方案和内部控制划分为准备进入4.5毫升等分在无菌培养基无菌16X 100毫米的样品制备的玻璃试管，10.8毫升等分
- 在37 ° C孵育48小时，以验证不育（浊度缺乏）
- 在2-8 °与电容C商店紧闭长达1个月
注 ：每个痰标本需要一个管7H9培养基含有4.5毫升
- 抗生素的库存解决方案
- A.异烟肼股票（8 mg / ml的）
- 溶解完全在2.5毫升无菌蒸馏水20毫克异烟肼
- 0.2μm的注射器过滤器过滤水溶剂
- 在20μL无菌微型离心管分装于-20 ° C存储长达6个月
注 ：每个存储20μL等分是足够100个样本（包括浪费）
- B.利福平的股票（8 mg / ml的）
- 完全溶解20毫克利福平1.25毫升二甲基亚砜
- 添加1.25毫升无菌蒸馏水和混合
- 有机溶剂过滤0.2μm的注射器过滤器
- 在20μL无菌离心管分装于-20 ° C存储长达6个月
注 ：每个存储20μL等分是足够100个样本（包括浪费）
- A.异烟肼股票（8 mg / ml的）
- 磷酸盐缓冲库存
- 准备工作的解决方案
- 除污工作解决方案
- NALC晶体溶解在每一个净化所需的解决方案20毫升0.1克
注 ：每个样本需要2毫升去污液
注 ：放弃任何氢氧化钠NALC去污解决方案，仍然未使用24小时后，作为NALC随着时间的推移失去mucolytic活动
- NALC晶体溶解在每一个净化所需的解决方案20毫升0.1克
- 文化媒体工作的解决方案
- 列明：
- 1管与7H9培养基每痰标本进行处理，再加上每板1管（阴性对照列）
- 2 7H9培养基为阳性对照管（3如果monoresistant株）
- 1-2与抗生素溶液的制备10.8毫升7H9试管
- 每个样品管中添加0.5毫升OADC 7H94.5毫升
- 添加1.2毫升OADC管10.8毫升7H9
- 抛开5毫升7H9 - OADC为阳性对照，与管12毫升7H9 - OADC要使用抗生素溶液的配制（不需要潘塔）（S）2管
- 重组潘塔，并添加0.1毫升到每个样品管和阴性对照管（7H9 - OADC潘塔：总体积=5.1毫升）
注 ：潘塔（7H9 - OADC潘塔 ）的完全培养基用于痰标本和阴性对照;没有潘塔使用7H9 - OADC为阳性对照，抗生素溶液的制备
- 列明：
- 抗生素工作方案
- 1。参见图1，在未使用的24孔板抗生素的工作方案的步骤
注 ： 准确的药敏结果，最后的抗生素浓度是至关重要的 。 下面的过程是为laboratories配备与微量。如果不可用微量，结核菌素注射器可以使用不同的稀释系列指南附录3中所述的用户在modsperu.org
注意 ： 请不要再冻结或重新使用抗生素的工作或股票解决方案，作为药物活性 ，可能会丢失，丢弃所有未使用的抗生素解决方案，在处理天图1月底。使抗生素工作方案（用户指南在modsperu.org）
- 1。参见图1，在未使用的24孔板抗生素的工作方案的步骤
- 除污工作解决方案
- 痰标本和板的制备
- 去污
- 痰标本的放置到一个15ml离心管（如果2毫升少，弥补至2ml，用磷酸盐缓冲液，如果有更多的，只能使用2毫升）
- 加2ml氢氧化钠NALC解决方案
- 第管紧紧地和20秒的旋涡;反转管，以确保氢氧化钠NALC解决方案接触整个管内表面和盖子
- 静置至少15分钟 - 如果样品特别是粘稠的，可以延长几分钟。为了避免过度治疗， 不应超过20分钟
- 填写用磷酸盐缓冲液（pH值6.8）管14毫升以消除碱和终止的净化过程，拌匀反相管的4倍
- 离心15分钟（在modsperu.org用户指南附录2方程要达到3000克每分钟旋转3000克）
- 小心倒出上清液进入一个液体废物的容器，用10％的次氯酸钠或其他合适的消毒剂，并保留沉淀
- 最终样品悬浮液的制备和备份
- 使用7H9 - OADC潘塔（从试管中5.1毫升），样品颗粒悬浮在一个总量各2ml离心管中的巴斯德吸管;拌匀
- 在2-8℃的样品悬挂系统和存储在离心管中取出作为备份1毫升
- 添加第二个1ml到样品悬挂其余7H9 - OADC潘塔管;拌匀。这是最后的样品溶液，电镀
- 放入24孔板的样品悬浮液
- 将900μl的最终样品悬挂到每个列的4井在24孔板
- 额外的样品重复，直到第3列，该板块的所有列，除填补（或直到所有样本均镀）
- 7H9 - OADC介质的地方900μl样本没有在每个样品盘的第3列的4口井（消极的内部控制）
- 样品中添加抗生素
- 使用多道移液器，认真填写7H9 - OADC和抗生素的工作解决方案（2列抗生素稀释板见图1）井100μL4要诀
- 不接触板或样品添加100μL等分列1井900μl样品溶液
- 重复，直到所有的列已经收到了额外的介质的100μL（无毒品井）或抗生素的解决方案（包括阴性对照列3）
- 关闭盖放置在一个密封的聚乙烯袋（自封袋）和密封板（ 袋是不是从这时开始再次打开 ）
- 孵育温度37 ° C（CO 2的浓缩，是没有必要）
- 去污
- 质量控制
- 阴性对照，每盘上运行。阴性对照列的任何水井中的任何增长的存在表明交叉污染，因此整个板块必须被丢弃，重新镀金的样品。
- 阳性对照是运行在一个单独的板块，在这一天结束 。一个完全对药物敏感的菌株是在一列和应变耐INH和RIF是运行在另一列运行。如果有运行的多药耐药株的关注，既是异烟肼monoresistant应变和一个RIF的monoresistant应变可以在运行的敏感和多药耐药株。所有阳性对照应在无毒井的增长表明，媒体支持经济增长。为了证明是正确的药物浓度，不应成长敏感品系在INH或RIF井，但耐多药菌株增长也增长在INH和RIF井。
- 读板
- 随着电镀一天“0天”，读板从5日开始，并如果是负数，第5天的阅读是每一天，直到第14天，然后从第15天，每2-3天（或根据工作量的替代天） -21。板块研究上与10倍的目标倒光镜
- 培养阳性 ，其中有两个或两个以上的菌落形成单位（> 2 CFU）无毒井。早期的结核分枝杆菌生长，看起来像小弯逗号或螺旋（5-9天）。集落形成通常的进展，以“线”或“缠结”（上modsperu.org看到的图片库）
- 当天的文化是积极的无毒2井，含药井应阅读。 任何一种药物的存在增长表明该药物的抵抗力。
注 ：如果含药井阅读> 1周后做一个积极的文化是在无毒井指出，这未必代表突破增长阻力是偶尔看到
- 样品21天不积极被认为是负面的文化
- 浑浊的水井是一个污染繁茂的结果，而不会导致结核分枝杆菌生长在混浊
- 在完成21天的文化可能会被丢弃。文化留在各自的密封袋，被放置在高压灭菌袋在121-124 ° C灭菌45-60分钟
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Discussion
MODS的实验是针对资源有限的环境。这是第一次，MODS的带来的快速液体培养法检测肺结核的能力和资源有限的环境测试3元多药耐药结核病。 MODS是一个非专有的，迭代的方法，和MODS的社会总是在其他实验室已设法使改善。
是一个经常性的关注，是因为液体可以溢出或雾化的液体介质中的结核病文化的生物安全。我们相信，MODS的检测是比任何实验，涉及的间接药敏试验BIOSAFE间接药敏试验，因为涉及操纵分枝杆菌与溢出和气雾随之而来的风险高度集中的解决方案;相比之下，MODS的只涉及接种成一盘的痰标本，后板是一个塑料袋内密封，并永远不会再打开。这是由韩国2007年（金），这表明，镀出无痰标本做药敏试验的实验室工人的职业风险是没有比在做痰涂片显微镜检查的工人更大的数据支持;相反，那些做毒品药敏试验对结核病的职业风险要高得多。
我们强烈建议这些程序都没有适当的预防措施，实验室工作人员进行。这包括个人呼吸保护，2级生物安全柜，用尽空气通过HEPA过滤器过滤，和一个实验室的门上的锁，停止气流的动荡，而样本被操纵的N - 95口罩。
处理肺外结核样品的标准操作程序，tubercuclosis分枝杆菌和其他分枝杆菌，细菌和真菌污染的照片库，推荐的质量保证策略，实验室开始使用MODS的评审程序，以及一个FAQ表modsperu.org
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Acknowledgments
我们想确认为结核病的增长时间推移视频片段菲茨沃特肖恩和卡门Giannina月神科伦坡。马蒂罗珀我们感谢她彻底和极好的反馈，在编辑和共同创作的用户指南，从目前的协议大多是采取逐字。制作这个视频是由美国国立卫生研究院/ Fogarty国际中心的资助 http://www.fic.nih.gov/大卫AJ摩尔贡献威康信托在热带医学和读者临床研究员在英国伦敦帝国学院的传染病（奖学金获奖数量078067/Z/05）。马克F.布雷迪贡献作为美国国立卫生研究院/福格蒂国际中心研究员。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Refrigerator/ freezer | Equipment | to store pre-prepared broth and antibiotic stocks | ||
| Vortex | Equipment | to aid sputum decontamination | ||
| Centrifuge | Equipment | for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; d–s not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed) | ||
| Incubator (37 degree C) | Equipment | for culture; need not be CO2 enriched | ||
| Inverted light microscope | Microscope | to read MODS plates | ||
| Autoclave | Equipment | to sterilize media, PBS and used plates | ||
| Balance | Equipment | to weigh isoniazid, rifampicin and NALC | ||
| Middlebrook 7H9 broth (Difco) | Reagent | Fisher Scientific | DF0713-17-9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Casitone (pancreatic digest casein) | Reagent | Fisher Scientific | DF0259‐17‐9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Glycerol (glycerin) lyophilized | Reagent | Sigma-Aldrich | G‐33‐500 | 500ml/bottle; culture media base |
| PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) | Reagent | Fisher Scientific | B4345114 | 6 bottles/pack; antibiotic media supplement |
| OADC (Middlebrook OADC enrichment BD) | Reagent | Fisher Scientific | B11886 | 10 x 20ml/pack; nutritional media supplement |
| Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max) | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | 100ml/bottle; to prepare rifampicin stock |
| Antibiotic stocks: isoniazid | Reagent | Sigma-Aldrich | I-3377 | 50gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Antibiotic stocks: rifampicin | Reagent | Sigma-Aldrich | R-3501 | 1gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Sodium hydroxide (pellets) | Reagent | Sigma-Aldrich | 221465 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium citrate (trisodium salt dihydrate) | Reagent | Sigma-Aldrich | S-4641 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| N-acetyl-L-cysteine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7250 | 50gr/bottle; sputum decontamination |
| Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | P0662 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | S0876 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium hypochlorite | Reagent | household bleach | to discard contaminated waste | |
| 15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35‐2096) | Consumable | Fisher Scientific | 14‐959‐49B | 500ea/case; for sputum decontamination and concentration |
| 24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047) | Consumable | Fisher Scientific | 08-772-1 | 50 plates/case; for culture and reading |
| Sealable polythene bags 6 X 6 “ (ziplock) | Consumable | for biosecurity to contain 24 well plate | ||
| Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm) | Consumable | VWR international | 47729-583 | 500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth |
| Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml) | Consumable | Fisher Scientific | 05‐669‐22 | 1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue | Consumable | Fisher Scientific | SLGL 025 OS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow | Consumable | Fisher Scientific | SLGV 033 RS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9″ | Consumable | Fisher Scientific | 13‐678‐20C | 720ea/case; to mix PANTA with media mix |
| Aerosol barrier tips 1000‐1300μl | Consumable | Fisher Scientific | 02‐707‐51 | 1000ea/pk; to dispense media into plate |
| USA Scientific Tips One 1‐200μl yellow tips | Consumable | Fisher Scientific | 1111‐0006 | 1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks |
References
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