Summary
Die mikroskopische Beobachtung-Drug-Anfälligkeit (MODS) Test ist ein low-cost, low-tech Werkzeug für High-Performance-Nachweis von Tuberkulose (TB) und multiresistenter Tuberkulose (MDRTB). Dieses Video beschreibt die MODS flüssigen Medien Kultur-Methode.
Abstract
Patienten mit aktiver Lungentuberkulose (TB) infiziert 10-15 anderen Personen pro Jahr, was die Diagnose einer aktiven TB unerlässlich, sowohl Heilung des Patienten und die Verhinderung neuer Infektionen. Darüber hinaus bedeutet die Entstehung von multiresistenten Tuberkulose (MDRTB), die Detektion von Resistenzen ist notwendig für die Ausbreitung von resistenten Stämmen. Die mikroskopische Beobachtung-Drug-Anfälligkeit (MODS) Test ist ein low-cost, low-tech Werkzeug für High-Performance-Nachweis von TB und MDRTB. Der MODS Test basiert auf drei Prinzipien: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) wächst schneller in flüssigen Medien als auf festen Medien 2) mikroskopische MTB Wachstum kann früher in flüssigen Medien als das Warten auf das makroskopische Aussehen der Kolonien auf festen Medien erkannt werden, und dass das Wachstum ist charakteristisch für MTB, so dass sie von atypischen Mykobakterien oder Pilz-oder Bakterienbefall 3) unterschieden werden die Medikamente Isoniazid und Rifampicin in den MODS Test kann aufgenommen werden, um für den gleichzeitigen direkten Nachweis von MDRTB ermöglichen, so dass kein Bedarf für Subkultur zu erfüllen eine indirekte Sensibilitätstest testen. Konkurrierende aktuelle Diagnostik zeichnen sich durch geringe Empfindlichkeit mit Sputum, lange Wartezeiten bis zur Diagnose mit festen Medien Kultur, prohibitiv hohen Kosten mit vorhandenen flüssigen Medien Kultur Methoden und die Notwendigkeit, Subkultur für indirekte Drogen Empfindlichkeitsprüfung zu MDRTB erkennen Sie behindert. Im Gegensatz dazu hat die nicht-proprietäre MODS-Methode eine hohe Empfindlichkeit für TB und MDRTB, ist eine relativ schnelle Kultur-Methode ermöglicht die gleichzeitige Medikament Empfindlichkeitsprüfung für MDRTB, und ist zugänglich mit beschränkten Ressourcen knapp 3 $ für den Test für TB und MDRTB.
Protocol
- Stammlösungen
- Phosphatpuffer Lager
- Mix 950ml Natrium dibasischen Lösung (9.47g von Natriumdihydrogenphosphat in 1000ml destilliertem Wasser gelöst) mit 950ml Kaliumphosphat einbasischen Lösung (9.07g Kaliumphosphat einbasischen in 1000ml destilliertem Wasser gelöst) und rühren; zurückzuhalten 50ml jeder Lösung anpassen pH ggf.
- Der pH-Wert auf 6,8 ± 0,2: add Natriumdihydrogenphosphat-Lösung auf pH-Wert anzuheben, fügen Kaliumphosphat einbasischen Lösung für niedrigeren pH-
- Autoklaven bei 121-124 ° C für 15 Minuten zu sterilisieren
- Platte eine 100 &mgr; Aliquot der Phosphatpufferlösung auf Nähragar Medium in einer Petrischale und bei 37 ° C für 48 Stunden zu bestätigen, Sterilität
- Im Kühlschrank lagern bei 2-8 ° C für bis zu 1 Monat
Hinweis: Jeder Sputumprobe erfordert 10ml Phosphat-Puffer-Lösung
- Dekontamination Lager
- Die gleiche Menge Natronlauge (8,0 g Natriumhydroxid in 200ml sterilem destilliertem Wasser gelöst) und Natrium-Citrat-Lösung (5,8 g Natriumcitrat in 200ml sterilem destilliertem Wasser destilliert)
- Mix und Autoklaven bei 121-124 ° C für 15 Minuten
- Im Kühlschrank lagern bei 2-8 ° C für bis zu 1 Monat
Hinweis: Jeder Sputumprobe erfordert 2ml Dekontamination Lager
- Kulturmedien Lager
- In 900ml sterilem destilliertem Wasser hinzufügen 3.1ml von Glycerin und 1,25 g des Casitone und 5,9 g von 7H9 Medium Pulver; Mischung unter ständigem Rühren bis zur vollständigen Auflösung
- Autoklaven bei 121-124 ° C für 15 Minuten
- Cool und teilen das sterile Medium in 4,5 ml Aliquots in sterile 16x 100 mm Glasröhren für die Probenvorbereitung und 10.8ml Aliquots für die Herstellung von Antibiotika-Lösungen und interne Kontrollen
- Bei 37 ° C für 48 Stunden, um die Sterilität (fehlende Trübung) überprüfen
- Bei 2-8 ° C mit Deckel dicht verschlossen bis zu 1 Monat
Hinweis: Jeder Sputumprobe erfordert ein Röhrchen mit 4,5 ml der 7H9-Medium
- Antibiotika-Stammlösungen
- A. Isoniazid Lager (8 mg / ml)
- Lösen Sie 20 mg Isoniazid vollständig in 2,5 ml sterilem destilliertem Wasser
- Filter mit 0,2 um Spritzenfilter für wässrige Lösungsmittel
- Store in 20 &mgr; l Aliquots in sterile Mikro Zentrifugenröhrchen bei -20 ° C für bis zu 6 Monaten
Hinweis: Jede gespeicherte 20 &mgr; l Aliquot ist ausreichend für bis zu 100 Proben (einschließlich Verschnitt)
- B. Rifampicin Lager (8 mg / ml)
- Lösen Sie 20 mg Rifampicin komplett in 1,25 ml DMSO
- Add 1,25 ml sterilem destilliertem Wasser mischen
- Filter mit 0,2 um Spritze Filter für organische Lösungsmittel
- Store in 20 &mgr; l Aliquots in sterile Reaktionsgefäße bei -20 ° C für bis zu 6 Monaten
Hinweis: Jede gespeicherte 20 &mgr; l Aliquot ist ausreichend für bis zu 100 Proben (einschließlich Verschnitt)
- A. Isoniazid Lager (8 mg / ml)
- Phosphatpuffer Lager
- Bereiten Sie funktionierende Lösungen
- Dekontamination funktionierende Lösung
- Lösen Sie 0,1 g NALC Kristalle in jeder 20ml Dekontaminationslösung erforderlich
Hinweis: Jede Probe muss 2ml Dekontaminationslösung
Hinweis: Entsorgen Sie alle NaOH-NALC Dekontaminationslösung, dass ungenutzte nach 24 Stunden bleibt, wie NALC verliert seine schleimlösende Aktivität über die Zeit
- Lösen Sie 0,1 g NALC Kristalle in jeder 20ml Dekontaminationslösung erforderlich
- Kulturmedien funktionierende Lösung
- Set aus:
- 1 Tube mit 7H9 Medium für jeden Sputumprobe verarbeitet, plus 1 zusätzliches Rohr für jede Platte (für die Negativkontrolle Spalte)
- 2 Tuben 7H9 Medium für die positive Kontrolle (3, wenn monoresistant Stämme verwendet werden)
- 1-2 Röhren mit 10.8ml 7H9 für Antibiotika-Lösung Vorbereitung
- Fügen Sie 0,5 ml OADC die 4.5ml von 7H9 in jedem Probenröhrchen
- Fügen Sie 1,2 ml OADC Rohre mit 10.8ml 7H9
- Beiseite 2 Schläuche mit 5 ml 7H9-OADC für positive Kontrollen und Röhre (n) mit 12ml 7H9-OADC für Antibiotika-Lösung der Zubereitung verwendet werden (diese müssen nicht PANTA)
- Rekonstituieren PANTA und fügen 0.1ml jedes Probenröhrchen und die negative Kontrolle Röhren (7H9-OADC-PANTA: Gesamtvolumen = 5.1ml)
Hinweis: Vollmedium mit PANTA (7H9-OADC-PANTA) ist für die Sputum-Proben und negative Kontrollen verwendet; verwenden 7H9-OADC ohne PANTA für positive Kontrollen und für die Antibiotika-Lösung Vorbereitung
- Set aus:
- Antibiotika funktionierende Lösungen
- 1. Siehe Abbildung 1 für die Schritte zu machen das Antibiotikum funktionierende Lösung in einem unbenutzten 24-Well-Platte
Hinweis: Für eine genaue Anfälligkeit Ergebnisse sind die letzten Antibiotika-Konzentrationen kritisch. Das folgende Verfahren eignet sich für laboratories mit Mikropipetten ausgestattet. Wenn Mikropipetten nicht verfügbar sind, können Tuberkulinspritzen mit einer anderen Reihe von Verdünnungen in der Bedienungsanleitung beschrieben Leitfaden Anlage 3 zu modsperu.org verwendet werden
Hinweis: Nicht wieder einfrieren oder Wiederverwendung Antibiotikum arbeiten oder Stammlösungen als Droge Aktivität verloren gehen kann Entsorgen Sie alle unbenutzten antibiotische Lösungen am Ende des Verarbeitungstag Abbildung 1.. Herstellung des Antibiotikums funktionierende Lösungen (von User Guide bei modsperu.org)
- 1. Siehe Abbildung 1 für die Schritte zu machen das Antibiotikum funktionierende Lösung in einem unbenutzten 24-Well-Platte
- Dekontamination funktionierende Lösung
- Sputumprobe und Platte Vorbereitung
- Dekontamination
- Legen Sie 2ml von Sputum-Probe in einen 15 ml Zentrifugenröhrchen (wenn auch weniger, bis zur 2ml mit Phosphat-Puffer, wenn mehr, nur 2 ml)
- Add 2ml NaOH-Lösung NALC
- Cap Röhrchen fest und Vortex für 20 Sekunden; das Röhrchen, um sicherzustellen, NaOH-Lösung NALC Kontakte die gesamte Innenfläche der Röhre und Deckel
- Lassen Sie Standplatz für ein Minimum von 15 Minuten - kann durch ein paar Minuten zu verlängern, wenn die Probe ist besonders dickflüssig. Um zu vermeiden, über Behandlung sollte nicht länger als 20 Minuten
- Füllen Sie den Schlauch 14ml mit Phosphatpuffer (pH 6,8) zu neutralisieren Alkali und beenden die Dekontamination und gut mischen durch Invertieren des Röhrchens 4 mal
- Zentrifugation bei 3000 g für 15 Minuten (siehe Anhang 2 in Benutzerhandbuch unter modsperu.org für Gleichung Umdrehungen pro Minute notwendig, 3000 g zu erreichen)
- Vorsichtig abgießen Überstand in ein flüssiges Abfallbehälter mit 10% Natriumhypochlorit oder einem anderen geeigneten Desinfektionsmittel und behalten das Pellet
- Vorbereitung der endgültigen Stichprobe Aufhängung und Sicherung
- Mit 7H9-OADC-PANTA (aus der Tube mit 5.1ml), resuspendieren der Probe Pellet in einem Gesamtvolumen von 2 ml im Zentrifugenglas mit einer Pasteurpipette, gut mischen
- Nehmen Sie 1 ml Probe Federung und an einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 2-8 ° C als Backup
- Fügen Sie den zweiten 1 ml Probe Suspension auf das Rohr mit dem restlichen 7H9-OADC-PANTA; gut mischen. Dies ist die letzte Probe-Lösung bereit, für die Beschichtung
- Platzieren Probe Suspensionen in 24-Well-Platte
- Legen Sie 900μl der Endprobe Suspension in jedem der 4 Vertiefungen einer Spalte in der 24-Well-Platte
- Wiederholen Sie dies mit zusätzlichen Proben, bis alle Spalten der Platte, außer Spalte 3, gefüllt sind (oder bis alle Proben sind vernickelt)
- Legen Sie 900μl der 7H9-OADC Medium ohne Probe in die 4 Vertiefungen der Spalte 3 jeder Probe Platte (negative interne Kontrollen)
- Hinzufügen Antibiotika, um Proben
- Mit einer Multi-Kanal-Pipette sorgfältig ausfüllen 4 Spitzen mit 100 &mgr; l aus dem Brunnen mit 7H9-OADC und Antibiotika funktionierende Lösungen (Spalte 2 in Antibiotikum Verdünnungsplatte-siehe Abbildung 1)
- Fügen Sie die 100 &mgr; Aliquots der Spalte 1 Brunnen mit 900μl Probe-Lösungen ohne sie zu berühren Platte oder Probe
- Wiederholen, bis alle Spalten der zusätzlichen 100 &mgr; des Mediums (drug-free Brunnen) oder antibiotischen Lösungen (einschließlich Negativkontrolle Spalte 3) erhalten haben
- Schließen Sie die Platte mit dem Deckel und in einen verschließbaren Plastikbeutel (Ziplock) Tasche und Dichtung (Tasche nicht wieder ab diesem Zeitpunkt geöffnet)
- Bei 37 ° C (CO 2-Anreicherung ist nicht nötig)
- Dekontamination
- Qualitätskontrolle
- Negative Kontrollen sind auf jeder Platte laufen. Das Vorhandensein von Wachstum in einem der Brunnen in der negativen Kontrolle Spalte gibt Kreuzkontaminationen, also die gesamte Platte muss entsorgt werden und die Proben erneut beschichtet.
- Positive Kontrollen werden auf einer separaten Platte am Ende des Tages ausgeführt werden. Ein voll Drogen anfälligen Stamm in einer Spalte und einer Sorte resistent gegen INH und RIF ist in einer anderen Spalte ausführen ausführen. Wenn es Bedenken hinsichtlich Ausführung einer MDR-Stamm, sowohl eine INH monoresistant Belastung und ein RIF monoresistant Stamm kann an die Stelle der anfälligen und MDR-Stämme ausgeführt werden. Alle positiven Kontrollen sollten das Wachstum in der Arzneimittel-Vertiefungen, die frei zu, dass die Medien unterstützen das Wachstum zu demonstrieren. Um zu demonstrieren, dass die Wirkstoffkonzentrationen korrekt sind, sollte die anfälligen Stamm nicht in der INH oder RIF Brunnen wachsen, aber der MDR-Stamm sollte auch wachsen in der INH und RIF Brunnen wachsen.
- Mikrotiterplatten
- Mit dem Tag der Beschichtung als "Tag 0"-Platte zu lesen beginnt am Tag 5, und wenn sie negativ an Tag 5 Lesen geschieht jeden Tag (oder jeden zweiten Tag je nach Auslastung) bis Tag 14 und dann alle 2-3 Tage ab Tag 15 -21. Die Platten werden auf eine Prüfunginvertierten Lichtmikroskop mit dem 10fach Objektiv
- Eine positive Kultur ist eine, in der es zwei oder mehr Kolonie bildende Einheiten (> 2 CFU) in beiden drogenfreien Brunnen. Frühe mykobakterielle Wachstum sieht aus wie kleine geschwungene Kommata oder Spiralen (Tage 5-9). Colony Formation sich normalerweise auf "Kabel" oder "Knäuel" (siehe Bild-Bibliothek auf modsperu.org)
- An dem Tag, eine Kultur ist in den 2 drogenfreien Brunnen, der Wirkstoff-enthaltenden Vertiefungen gelesen werden sollte positiv sein. Jede Wachstum in Gegenwart eines Medikaments zeigt Resistenz gegen dieses Medikament.
Hinweis: Wenn das Lesen der Arzneimittel enthaltenden Brunnen ist fertig> 1 Woche nach einer positiven Kultur in der drogenfreien Brunnen festgestellt wird, kann dies nicht darstellen Widerstand als Durchbruch Wachstum wird gelegentlich gesehen
- Proben, die nicht durch Tag 21 positiv als negativ Kulturen
- Eine Trübung der Brunnen ist ein Ergebnis der Verunreinigung Überwucherung, während mykobakterielle Wachstum nicht zu Trübungen führen
- Nach Abschluss der 21 Tage Kulturen verworfen werden kann. Kulturen bleiben in ihren Beuteln und Säcken in Autoklaven gestellt und autoklaviert bei 121-124 ° C 45-60 Minuten
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Discussion
Der MODS Test ist mit beschränkten Ressourcen angestrebt. Zum ersten Mal bringt MODS die Fähigkeit zur schnellen flüssigen Kultur Erkennung von Tuberkulose und multiresistenten Tuberkulose mit beschränkten Ressourcen knapp 3 $ pro Test. MODS ist ein nicht-proprietäres, iterative Methodik und die MODS-Community ist immer in Verbesserungen, die andere Labors haben es geschafft, interessiert.
Ein immer wiederkehrendes Problem ist die Biosicherheit von flüssigen Medien Kultur der Tuberkulose, weil Flüssigkeiten verschüttet oder vernebelt werden. Wir glauben, dass die MODS Test mehr BIOSAFE als jeder Test, der beteiligten indirekte Drogen Empfindlichkeitsprüfung ist, weil indirekte Drogen Empfindlichkeitsprüfung beinhaltet die Manipulation von hochkonzentrierten Lösungen von Mykobakterien mit den damit verbundenen Risiken der Freisetzung und Aerosolisierung, im Gegensatz, MODS werden einfach die Impfung von Sputums Probe in eine Platte, nach der die Platte ist in einer Plastiktüte versiegelt und nie wieder eröffnet. Dies wird durch Daten aus Korea (Kim 2007), dass die Risiken am Arbeitsplatz im Labor Arbeitnehmer, die Sputum-Proben, ohne dabei Drogen-Empfindlichkeitsprüfung vergoldet war nicht größer als bei Arbeitern zu tun Sputum-Mikroskopie zeigte unterstützt, im Gegensatz dazu jene tun, Drogen- Empfindlichkeitsprüfung hatte viel höhere berufliche Risiko für Tuberkulose.
Wir empfehlen dringend, dass keines dieser Verfahren ohne entsprechende Vorsichtsmaßnahmen für die Laboranten durchgeführt werden. Dazu gehören N-95 Masken für den persönlichen Atemschutz, Klasse 2 biologische Sicherheit Schrank mit Abluft durch HEPA-Filter filtriert, und eine Sperre für das Labor Tür zu Turbulenzen des Luftstroms zu stoppen, während Proben manipuliert werden.
Standard Operating Procedures für die Verarbeitung von extrapulmonalen Proben, eine Foto-Bibliothek von Mycobacterium tubercuclosis und andere Mykobakterien und Bakterien-und Pilzbefall, eine empfohlene Qualitätssicherung Strategie, ein Verfahren zur Akkreditierung von Laboratorien zu verwenden zu beginnen MODS, und eine FAQ Blatt sind verfügbar unter modsperu.org
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Acknowledgments
Wir möchten Sean Fitzwater und Carmen Giannina Luna Colombo für die Tuberkulose-Wachstum Zeitraffer-Video-Segment zu bestätigen. Wir danken Marty Roper für ihre gründliche und sehr gutes Feedback während der Bearbeitung und Co-Autor der User Guide, von der die aktuelle Protokoll übernommen meist wörtlich wurde. Die Produktion dieses Video wurde von den NIH / Fogarty International Center finanziert http://www.fic.nih.gov/ David AJ Moore trug als Wellcome Trust Clinical Research Fellow in Tropenmedizin und Reader in Infectious Diseases am Imperial College London (Fellowship Auszeichnung Zahl 078067/Z/05). Mark F. Brady beigetragen als NIH / Fogarty International Center Research Fellow.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Refrigerator/ freezer | Equipment | to store pre-prepared broth and antibiotic stocks | ||
| Vortex | Equipment | to aid sputum decontamination | ||
| Centrifuge | Equipment | for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; d–s not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed) | ||
| Incubator (37 degree C) | Equipment | for culture; need not be CO2 enriched | ||
| Inverted light microscope | Microscope | to read MODS plates | ||
| Autoclave | Equipment | to sterilize media, PBS and used plates | ||
| Balance | Equipment | to weigh isoniazid, rifampicin and NALC | ||
| Middlebrook 7H9 broth (Difco) | Reagent | Fisher Scientific | DF0713-17-9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Casitone (pancreatic digest casein) | Reagent | Fisher Scientific | DF0259‐17‐9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Glycerol (glycerin) lyophilized | Reagent | Sigma-Aldrich | G‐33‐500 | 500ml/bottle; culture media base |
| PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) | Reagent | Fisher Scientific | B4345114 | 6 bottles/pack; antibiotic media supplement |
| OADC (Middlebrook OADC enrichment BD) | Reagent | Fisher Scientific | B11886 | 10 x 20ml/pack; nutritional media supplement |
| Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max) | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | 100ml/bottle; to prepare rifampicin stock |
| Antibiotic stocks: isoniazid | Reagent | Sigma-Aldrich | I-3377 | 50gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Antibiotic stocks: rifampicin | Reagent | Sigma-Aldrich | R-3501 | 1gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Sodium hydroxide (pellets) | Reagent | Sigma-Aldrich | 221465 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium citrate (trisodium salt dihydrate) | Reagent | Sigma-Aldrich | S-4641 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| N-acetyl-L-cysteine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7250 | 50gr/bottle; sputum decontamination |
| Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | P0662 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | S0876 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium hypochlorite | Reagent | household bleach | to discard contaminated waste | |
| 15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35‐2096) | Consumable | Fisher Scientific | 14‐959‐49B | 500ea/case; for sputum decontamination and concentration |
| 24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047) | Consumable | Fisher Scientific | 08-772-1 | 50 plates/case; for culture and reading |
| Sealable polythene bags 6 X 6 “ (ziplock) | Consumable | for biosecurity to contain 24 well plate | ||
| Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm) | Consumable | VWR international | 47729-583 | 500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth |
| Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml) | Consumable | Fisher Scientific | 05‐669‐22 | 1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue | Consumable | Fisher Scientific | SLGL 025 OS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow | Consumable | Fisher Scientific | SLGV 033 RS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9″ | Consumable | Fisher Scientific | 13‐678‐20C | 720ea/case; to mix PANTA with media mix |
| Aerosol barrier tips 1000‐1300μl | Consumable | Fisher Scientific | 02‐707‐51 | 1000ea/pk; to dispense media into plate |
| USA Scientific Tips One 1‐200μl yellow tips | Consumable | Fisher Scientific | 1111‐0006 | 1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks |
References
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