Summary
Микроскопического наблюдения восприимчивости к лекарствам (MODS) анализа является низкая стоимость, высокие технологии инструмент для высокопроизводительных выявления туберкулеза (ТБ) и множественной лекарственной устойчивостью туберкулеза (MDRTB). Это видео описывает MODS жидких питательных сред методом.
Abstract
Пациенты с активным туберкулезом легких (ТБ) заразить 10-15 других лиц в год, что делает диагностики активного туберкулеза важны как для лечения пациента и предотвращение новых случаев инфицирования. Кроме того, появление множественной лекарственной устойчивостью (MDRTB) означает, что для обнаружения лекарственной устойчивости является необходимым для предотвращения распространения лекарственно-устойчивых штаммов. Микроскопического наблюдения восприимчивости к лекарствам (MODS) анализа является низкая стоимость, высокие технологии инструмент для высокопроизводительных выявление туберкулеза и MDRTB. Анализ MODS основана на трех принципах: 1) микобактерии туберкулеза (МТБ) растет быстрее, в жидких средах, чем на твердой среде 2) микроскопического роста MTB могут быть обнаружены ранее в жидких средах, не дожидаясь появления макроскопических колоний на твердых средах, а также что рост характерно MTB, что позволяет ему следует отличать от атипичных микобактерий или грибкового или бактериального загрязнения 3) препараты изониазид и рифампицин могут быть включены в анализ MODS, чтобы обеспечить одновременное прямое обнаружение MDRTB, что исключает необходимость в субкультуру для выполнения косвенный тест восприимчивость препарата. Конкурирующие текущей диагностики сдерживается низкой чувствительности посредством исследования мокроты, длительные задержки, пока диагноз с твердой питательной среды, непомерно высокой стоимостью с существующими жидких питательных средах методами и нужно сделать субкультуру для косвенного исследования чувствительности для обнаружения наркотиков MDRTB. В отличие от неимущественных MODS метод обладает высокой чувствительностью к туберкулезу и MDRTB, является относительно быстрое культуры метод обеспечивает одновременное тестирование на чувствительность препарат для MDRTB, и доступна с ограниченными ресурсами чуть менее $ 3 для проверки на туберкулез и MDRTB.
Protocol
- Подготовка исходных растворов
- Фосфат буферный запас
- Mix 950ml раствора натрия двузамещенный (9.47g натрия фосфат двузамещенный растворяется в 1000 мл дистиллированной воды) с 950ml калия фосфат однозамещенный решение (9.07g калия фосфат однозамещенный растворяется в 1000 мл дистиллированной воды) и перемешать; удержать 50мл каждого решения для настройки рН при необходимости
- Отрегулируйте рН до 6,8 ± 0,2: добавить натрия фосфат двузамещенный решение повысить рН, добавить фосфат калия однозамещенный решение снизить рН
- Автоклаве при температуре 121-124 ° С в течение 15 минут для стерилизации
- Пластина 100 мкл аликвоту решение фосфатного буфера на питательной среде агара в чашке Петри и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 48 часов для подтверждения стерильности
- Хранить в холодильнике при температуре 2-8 ° С на срок до одного месяца
Примечание: Каждый мокроты требуется 10 мл фосфатного буферного раствора
- Обеззараживание акции
- Комбинат равные объемы раствора гидроксида натрия (8,0 г гидроксида натрия, растворенного в 200 мл стерильной дистиллированной воды) и раствор цитрата натрия (5.8g цитрата натрия в 200 мл дистиллированной стерильной дистиллированной воды)
- Смешайте и автоклаве при температуре 121-124 ° С в течение 15 минут
- Хранить в холодильнике при температуре 2-8 ° С на срок до одного месяца
Примечание: Каждый мокроты требуется 2 мл обеззараживания акции
- Культура СМИ фондового
- Into 900 мл стерильной дистиллированной воды добавить 3.1ml глицерина и 1.25 из casitone и 5.9g из 7H9 порошковой среды; смешать с постоянном перемешивании до полного растворения
- Автоклаве при температуре 121-124 ° С в течение 15 минут
- Охладить и разделить стерильной среды в 4,5 мл аликвоты в стерильные 16x 100 мм стеклянных трубок для подготовки проб и 10.8ml аликвоты для приготовления растворов и антибиотиков внутреннего контроля
- Инкубировать при 37 ° С в течение 48 часов, чтобы проверить стерильность (отсутствие мутности)
- Хранить при температуре 2-8 ° С с плотно закрытой крышкой на срок до одного месяца
Примечание: Каждый мокроты требует одного пробирку, содержащую 4,5 мл из 7H9 среда
- Антибиотик растворы
- А. Изониазид акции (8 мг / мл)
- Растворите 20 мг изониазида полностью в 2,5 мл стерильной дистиллированной воды
- Фильтр с фильтром 0,2 мкм шприц для водного растворителя
- Хранить в 20 мкл аликвоты в стерильные микропробирок центрифугирования при -20 ° C до 6 месяцев
Примечание: Каждый хранится 20 мкл аликвоту достаточно для 100 образцов (в том числе отходы)
- Б. Рифампицин акции (8 мг / мл)
- Растворите 20 мг рифампицина полностью в 1.25ml ДМСО
- Добавить 1.25ml стерильной дистиллированной воды и перемешать
- Фильтр с фильтром 0,2 мкм шприц для органического растворителя
- Хранить в 20 мкл аликвоты в стерильные пробирки микроцентрифужных при температуре -20 ° С до 6 месяцев
Примечание: Каждый хранится 20 мкл аликвоту достаточно для 100 образцов (в том числе отходы)
- А. Изониазид акции (8 мг / мл)
- Фосфат буферный запас
- Подготовка рабочих растворов
- Обеззараживание рабочего раствора
- Растворите 0,1 г из NALC кристаллов в каждой 20 мл обеззараживания решение требует
Примечание: Каждый образец потребности 2мл обеззараживания решение
Примечание: Не использовать NaOH-NALC обеззараживания решение, которое остается неиспользованной после 24 часов, как NALC теряет муколитическое деятельности с течением времени
- Растворите 0,1 г из NALC кристаллов в каждой 20 мл обеззараживания решение требует
- Культура СМИ рабочего раствора
- Изложить:
- 1 тюбик с 7H9 среды для каждого образца мокроты, подлежащих обработке, плюс 1 дополнительная трубка для каждой пластины (для отрицательных колонки управления)
- 2 трубы 7H9 средой для положительного контроля (3 monoresistant если штаммов используются)
- 1-2 труб с 10.8ml 7H9 для приготовления раствора антибиотика
- Добавить 0,5 мл OADC к 4,5 мл из 7H9 в каждой пробирки
- Добавить 1.2ml OADC для труб с 10.8ml 7H9
- Отложите 2 пробирки с 5 мл 7H9-OADC для положительного контроля, а также трубки (ы) с 12 мл 7H9-OADC которые будут использоваться для приготовления раствора антибиотиков (они не требуют PANTA)
- PANTA Развести и добавить 0,1 мл на каждый образец трубы и к отрицательному труб контроля (7H9-OADC-PANTA: общий объем = 5.1ml)
Примечание: Полное среде с PANTA (7H9-OADC-PANTA) используется для мокроты и отрицательный контроль, использование 7H9-OADC без PANTA для положительного контроля и для приготовления раствора антибиотика
- Изложить:
- Антибиотик рабочих растворов
- 1. См. рисунок 1 для шагов, чтобы сделать рабочий раствор антибиотика в неиспользованных 24-луночного планшета
Примечание: Для получения точных результатов восприимчивость, окончательные концентрации антибиотиков являются критическими. Следующая процедура подходит для лaboratories оснащен микропипетки. Если микропипетки отсутствуют, туберкулиновые шприцы могут быть использованы с различными серии разведений описано в руководстве пользователя Приложение 3 на modsperu.org
Примечание: Не повторно замораживать или повторное использование антибиотика работает или растворы, как наркотик деятельности могут быть потеряны Отменить все неиспользованные антибиотики решения в конце рис обработки день 1.. Создание рабочих растворов антибиотиков (из Руководства пользователя на modsperu.org)
- 1. См. рисунок 1 для шагов, чтобы сделать рабочий раствор антибиотика в неиспользованных 24-луночного планшета
- Обеззараживание рабочего раствора
- Образец мокроты и пластины подготовки
- Обеззараживание
- Место 2 мл мокроты в 15 мл центрифужную пробирку (если меньше, составляют до 2 мл с фосфатным буфером, а если больше, используйте только 2 мл)
- Добавить 2 мл NaOH-NALC решение
- Крышка трубки плотно и вихрь в течение 20 секунд; инвертировать трубки для обеспечения NaOH-NALC контакты решение всей внутренней поверхности трубки и крышки
- Пусть стоять в течение минимум 15 минут - может продлить на несколько минут, если образец особенно вязкой. Чтобы избежать лечения, не должна превышать 20 минут
- Заполните трубку с 14 мл фосфатного буфера (рН 6,8) для нейтрализации щелочи и прекращается процесс обеззараживания, и хорошо перемешать путем обращения трубки в 4 раза
- Центрифуга на 3000 г в течение 15 минут (см. Приложение 2 в Руководстве пользователя на modsperu.org для уравнения оборотов в минуту, необходимых для достижения 3000 г)
- Тщательно слейте надосадочную жидкость в контейнер для отходов на 10% гипохлорит натрия или других подходящих дезинфицирующих и сохранить гранул
- Подготовка окончательного подвески образца и резервного копирования
- Использование 7H9-OADC-PANTA (из трубки, содержащей 5.1ml), ресуспендируют образцов гранул в общем объеме 2 мл в центрифуге трубки с пипетки Пастера, хорошо перемешать
- Удалить 1 мл суспензии пробы и храните в микроцентрифужных трубки при температуре 2-8 ° С в качестве резервного
- Добавить 1 мл второго образца подвески к трубке с остальными 7H9-OADC-PANTA, хорошо перемешать. Это окончательное решение образца готово для нанесения покрытий
- Размещение образцов суспензий в 24-луночного планшета
- Место 900μl окончательного подвески образца в каждом из 4-х скважинах столбца в 24-луночного планшета
- Повторите с дополнительными образцами, пока все столбцы, пластины, за исключением Колонка 3, заполнены (или пока все образцы покрытием)
- Место 900μl из-7H9 OADC среды без образца в 4 скважинах Колонка 3 каждого образца пластину (отрицательный внутреннего контроля)
- Добавление антибиотиков для образцов
- Использование многоканальной пипетки, внимательно заполните 4 подсказки с 100 мкл из скважин с 7H9-OADC и антибиотиков рабочих растворов (колонка 2 антибиотика в разведении пластинчатых см. Рисунок 1)
- Добавить 100 мкл аликвоты в столбце 1 скважин с 900μl решений образце, не касаясь пластины или образец
- Повторяйте, пока все столбцы, получили дополнительные 100 мкл среды (свободной от наркотиков скважины) или антибиотики решений (в том числе отрицательные колонки управления 3)
- Закрыть пластины с крышкой и поместить в герметичные полиэтиленовые (Ziplock) мешок и печатью (сумка не началась снова с этого момента)
- Инкубировать при 37 ° C (CO 2 обогащения не нужно)
- Обеззараживание
- Контроль качества
- Отрицательные элементы управления работают на каждой пластине. Наличия какого-либо роста в любой из скважин в отрицательную колонки управления указывает перекрестного загрязнения, поэтому вся пластинка должна быть отброшена и образцы повторно покрытием.
- Положительные элементы управления работают на отдельную табличку, в конце дня. Один полностью лекарственно-чувствительного штамма работать в колонну и штамма, устойчивого к INH и RIF запускается в другом столбце. Если есть опасения о запуске MDR напряжения, как изониазид monoresistant процедить и РИФ monoresistant штамм может быть запущен в месте восприимчивы и MDR штаммами. Все положительные элементы управления должны иметь рост в свободной от наркотиков скважин, чтобы продемонстрировать, что рост медиа-поддержку. Чтобы продемонстрировать, что концентрации препарата верны, восприимчивых штамма не должны расти в INH или РИФ скважин, но MDR напряжение должно расти и расти в INH и RIF скважин.
- Пластина чтения
- В день посева, как "день 0", чтения автомобильного начинается на 5-й день, а если отрицательна на 5-й день чтения делается каждый день (или через день в зависимости от нагрузки) до 14-й день, а затем через каждые 2-3 дней с 15-й день -21. Плиты рассматриваются наперевернутый световой микроскоп с 10-кратным цель
- Позитивная культура является тот, в котором Есть два или более колониеобразующих единиц (> 2 КОЕ) в обоих без наркотиков скважин. Рано микобактериальные роста выглядят как маленькие изогнутые запятых или спиралей (дни 5-9). Колония образование обычно прогрессирует на «шнуры» или «связок» (см. Библиотека изображений по modsperu.org)
- В тот день, культуры положительно в 2 свободных от наркотиков скважин, наркосодержащих скважины должны быть прочитаны. Любой рост в присутствии препарата указывает, что устойчивость к препарату.
Примечание: Если чтение наркосодержащих скважин осуществляется> 1 неделю после положительной культуры отмечается в свободной от наркотиков скважин, это может не отражать сопротивление как прорыв рост иногда видели
- Образцы, которые не являются положительными на 21-й день считаются отрицательными культурами
- Облачность скважин является результатом загрязнения чрезмерно быстрый рост, в то время микобактериальные рост не приводит к облачность
- По завершении 21 дней культуры могут быть отброшены. Культуры остаются в опечатанных мешках и помещают в автоклав мешках и в автоклаве при 121-124 ° С в течение 45-60 минут
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ MODS ориентирован на условиях ограниченных ресурсов. В первый раз, MODS приносит способность к быстрому обнаружению жидкости культуры туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и туберкулеза с ограниченными ресурсами чуть менее $ 3 за тест. MODS является неимущественные, итерационные методологии и сообщества MODS всегда заинтересована в том, что улучшение других лабораториях удалось сделать.
Периодически озабоченность биобезопасности жидких питательных сред от туберкулеза, поскольку жидкость может быть пролита или аэрозольных. Мы считаем, что анализ MODS более biosafe, чем любой анализ, который участвует косвенное тестирование на чувствительность препарата из косвенных тестирования чувствительности наркотиков включает в себя манипуляции высококонцентрированных растворов микобактерий с сопутствующими рисками утечки и аэрозолизации, в отличие, MODS просто включает прививки мокроты в тарелку, после чего пластины запечатан в пластиковый пакет и никогда больше не открылся. Это подтверждается данными из Кореи (Ким 2007), которая показала, что профессиональный риск в лабораторию работников, которые покрытием из образцов мокроты, не делая их восприимчивости к лекарствам тестирования не было больше, чем в рабочие делают микроскопии мазка мокроты, в отличие от тех, кто занимается наркотиками тестирование на чувствительность была значительно выше профессионального риска по туберкулезу.
Мы настоятельно рекомендуем, чтобы ни одна из этих процедур будет осуществляться без надлежащих мер предосторожности для лабораторных работников. Это включает в себя N-95 масок для личной защиты органов дыхания, класс 2 кабинета биологической безопасности с выкачан воздух фильтруется через фильтры HEPA, и замок на дверь лаборатории, чтобы остановить турбулентности воздушного потока в то время как образцы манипулируют.
Стандартные операционные процедуры для обработки внелегочного образцы, фото-библиотеке микобактерий tubercuclosis и других микобактерий и бактериальные и грибковые загрязнения, рекомендуемая стратегия обеспечения качества, процедуры аккредитации лабораторий, чтобы начать использовать MODS, и лист FAQ можно найти на modsperu.org
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность Шон Фицуотер и Кармен Джаннина Луна Коломбо по туберкулезу роста покадровой видео сегменте. Мы благодарим Марти Ропер для ее тщательного и отличную обратную связь во время редактирования и совместного редактирования руководство пользователя, от которого текущего протокола было принято главным образом дословно. Производство этого видео был профинансирован NIH / Международный центр Фогарти http://www.fic.nih.gov/ Дэвид Мур AJ, вносимого в Wellcome Trust Клинические научный сотрудник в тропической медицины и лектор по инфекционным болезням из Имперского колледжа в Лондоне (стипендия награда число 078067/Z/05). Марк Ф. Брэди, вносимого в NIH / Фогарти Международный научный центр.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Refrigerator/ freezer | Equipment | to store pre-prepared broth and antibiotic stocks | ||
| Vortex | Equipment | to aid sputum decontamination | ||
| Centrifuge | Equipment | for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; d–s not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed) | ||
| Incubator (37 degree C) | Equipment | for culture; need not be CO2 enriched | ||
| Inverted light microscope | Microscope | to read MODS plates | ||
| Autoclave | Equipment | to sterilize media, PBS and used plates | ||
| Balance | Equipment | to weigh isoniazid, rifampicin and NALC | ||
| Middlebrook 7H9 broth (Difco) | Reagent | Fisher Scientific | DF0713-17-9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Casitone (pancreatic digest casein) | Reagent | Fisher Scientific | DF0259‐17‐9 | 500gr/bottle; culture media base |
| Glycerol (glycerin) lyophilized | Reagent | Sigma-Aldrich | G‐33‐500 | 500ml/bottle; culture media base |
| PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) | Reagent | Fisher Scientific | B4345114 | 6 bottles/pack; antibiotic media supplement |
| OADC (Middlebrook OADC enrichment BD) | Reagent | Fisher Scientific | B11886 | 10 x 20ml/pack; nutritional media supplement |
| Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max) | Reagent | Sigma-Aldrich | D-2650 | 100ml/bottle; to prepare rifampicin stock |
| Antibiotic stocks: isoniazid | Reagent | Sigma-Aldrich | I-3377 | 50gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Antibiotic stocks: rifampicin | Reagent | Sigma-Aldrich | R-3501 | 1gr/bottle; direct susceptibility testing |
| Sodium hydroxide (pellets) | Reagent | Sigma-Aldrich | 221465 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium citrate (trisodium salt dihydrate) | Reagent | Sigma-Aldrich | S-4641 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| N-acetyl-L-cysteine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7250 | 50gr/bottle; sputum decontamination |
| Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | P0662 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | S0876 | 500gr/bottle; sputum decontamination |
| Sodium hypochlorite | Reagent | household bleach | to discard contaminated waste | |
| 15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35‐2096) | Consumable | Fisher Scientific | 14‐959‐49B | 500ea/case; for sputum decontamination and concentration |
| 24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047) | Consumable | Fisher Scientific | 08-772-1 | 50 plates/case; for culture and reading |
| Sealable polythene bags 6 X 6 “ (ziplock) | Consumable | for biosecurity to contain 24 well plate | ||
| Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm) | Consumable | VWR international | 47729-583 | 500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth |
| Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml) | Consumable | Fisher Scientific | 05‐669‐22 | 1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue | Consumable | Fisher Scientific | SLGL 025 OS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| 0.22μm filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow | Consumable | Fisher Scientific | SLGV 033 RS | 50 units/case; to filter antibiotic stocks |
| Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9″ | Consumable | Fisher Scientific | 13‐678‐20C | 720ea/case; to mix PANTA with media mix |
| Aerosol barrier tips 1000‐1300μl | Consumable | Fisher Scientific | 02‐707‐51 | 1000ea/pk; to dispense media into plate |
| USA Scientific Tips One 1‐200μl yellow tips | Consumable | Fisher Scientific | 1111‐0006 | 1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks |
References
- Arias, M. Clinical evaluation of the microscopic-observation drug-susceptibility assay for detection of tuberculosis. Clin Infect Dis. 44, 674-674 (2007).
- Caviedes, L. Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures. The Tuberculosis Working Group in Peru. J Clin Microbiol. 38, 1203-1203 (2000).
- Caviedes, L., Moore, D. A. Introducing MODS: a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis. Indian J Med Microbiol. 25, 87-87 (2007).
- Caws, M. Evaluation of the MODS culture technique for the diagnosis of tuberculous meningitis. PLoS ONE. 2, e1173-e1173 (2007).
- Ejigu, G. S. Microscopic-observation drug susceptibility assay provides rapid and reliable identification of MDR-TB. Int J Tuberc Lung Dis. 12, 332-332 (2008).
- Kim, S. J. Risk of occupational tuberculosis in National Tuberculosis Programme laboratories in Korea. Int J Tuberc Lung Dis. 11, 138-138 (2007).
- Mello, F. C. Clinical evaluation of the microscopic observation drug susceptibility assay for detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to isoniazid or rifampin. J Clin Microbiol. 45, 3387-3387 (2007).
- Moore, D. A. Future prospects for the MODS assay in multidrug-resistant tuberculosis diagnosis. Future Microbiol. 2, 97-97 (2007).
- Moore, D. A. Infrequent MODS TB culture cross-contamination in a high-burden resource-poor setting. Diagn Microbiol Infect Dis. 56, 35-35 (2006).
- Moore, D. A. Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB. N Engl J Med. 355, 1539-1539 (2006).
- Moore, D. A. Microscopic observation drug susceptibility assay, a rapid, reliable diagnostic test for multidrug-resistant tuberculosis suitable for use in resource-poor settings. J Clin Microbiol. 42, 4432-4432 (2004).
- Moore, D. A., Roper, M. H. Diagnosis of smear-negative tuberculosis in people with HIV/AIDS. Lancet. 370, 1033-1033 (2007).
- Oberhelman, R. A. Improved recovery of Mycobacterium tuberculosis from children using the microscopic observation drug susceptibility method. Pediatrics. 118, e100-e100 (2006).
- Palomino, J. C., Martin, A., Portaels, F. MODS assay for the diagnosis of TB. N Engl J Med. 356, 188-189 (2007).
- Park, W. G., Bishai, W. R., Chaisson, R. E., Dorman, S. E. Performance of the microscopic observation drug susceptibility assay in drug susceptibility testing for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 40, 4750-4750 (2002).
- Shiferaw, G. Evaluation of microscopic observation drug susceptibility assay for detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 45, 1093-1093 (2007).
- Tovar, M. Improved diagnosis of pleural tuberculosis using the microscopic- observation drug-susceptibility technique. Clin Infect Dis. 46, 909-909 (2008).
- Vargas, D. Diagnosis of sputum-scarce HIV-associated pulmonary tuberculosis in Lima, Peru. Lancet. 365, 150-150 (2005).
