Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Försvarsministerierna metoden för diagnos av tuberkulos och multiresistent tuberkulos

Published: August 11, 2008 doi: 10.3791/845
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1The Warren Alpert Medical School of Brown University, 2Laboratorio de Investigacion de Enfermedades Infecciosas, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 3Department of International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 4Wellcome Trust Centre for Clinical Tropical Medicine, Imperial College London

Summary

Den mikroskopiska-observation narkotika känslighet (MODS)-analysen är en låg kostnad, låg-tech-verktyget för högpresterande upptäckt av tuberkulos (tbc) och multiresistent tuberkulos (MDRTB). Denna video beskriver MODS flytande mediekulturen metod.

Abstract

Patienter med aktiv lungtuberkulos (tbc) smitta 10-15 andra personer per år, vilket gör att diagnostisera aktiv TBC viktigt att både bota patienten och förhindra nya infektioner. Dessutom innebär uppkomsten av multiresistent tuberkulos (MDRTB) som upptäckt av resistens är nödvändigt för att stoppa spridningen av resistenta stammar. Den mikroskopiska-observation narkotika känslighet (MODS)-analysen är en låg kostnad, låg-tech-verktyget för högpresterande detektering av TB och MDRTB. Försvarsministerierna analysen är baserad på tre principer: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) växer snabbare i flytande medier än på fasta medier 2) mikroskopiska MTB tillväxt kan upptäckas tidigare i flytande medier än att vänta på den makroskopiska utseende kolonier på fasta medier och att tillväxten är karakteristisk för MTB, så att den kan särskiljas från atypiska mykobakterier eller svamp-eller bakterieangrepp 3) droger isoniazid och rifampicin kan införlivas i MODS-analysen för att möjliggöra samtidig direkt detektion av MDRTB, undanröja behovet av subkulturen för att utföra en indirekt drog resistensbestämning. Konkurrerande nuvarande diagnostiken försvåras av låg känslighet med slem cellprov, långa väntetider till diagnos med fasta medier kultur, oöverkomliga kostnader med befintliga likvida mediekultur metoder, och behovet av att göra subkultur för indirekta drog resistensbestämning för att upptäcka MDRTB. Däremot har den generiska MODS metoden en hög känslighet för TBC och MDRTB, är en relativt snabb kultur-metoden, ger samtidig testning drog känslighet för MDRTB, och är tillgänglig för begränsade resurser inställningar på strax under $ 3 för testning för tuberkulos och MDRTB.

Protocol

  1. Bered stamlösningar
    1. Fosfat buffertlager
      1. Blanda 950ml av natrium dibasiskt lösning (9.47g av Dinatriumvätefosfat upplöst i 1000 ml destillerat vatten) med 950ml av kalium monobasiskt lösning (9.07g av kalium monobasiskt upplöst i 1000 ml destillerat vatten) och rör om, hålla tillbaka 50 ml av varje lösning för att justera pH vid behov
      2. Justera pH till 6,8 ± 0,2: Lägg Dinatriumvätefosfat lösning för att höja pH-värde, lägga kalium monobasiskt lösning för att sänka pH
      3. Autoklav vid 121-124 ° C i 15 minuter för att sterilisera
      4. Tavla en 100μl alikvot av fosfatbuffertlösning på näringsämnen agarsubstrat i en petriskål och inkubera vid 37 ° C i 48 timmar för att bekräfta sterilitet
      5. Förvaras i kylskåp vid 2-8 ° C i upp till en månad

        Notera: Varje sputum urvalet kräver 10 ml fosfatbuffertlösning
    2. Sanering lager
      1. Kombinera lika stora volymer av natriumhydroxidlösning (8.0g av natriumhydroxid upplöst i 200 ml sterilt destillerat vatten) och natriumcitratlösning (5.8g av natriumcitrat destilleras i 200 ml sterilt destillerat vatten)
      2. Blanda och autoklav vid 121-124 ° C i 15 minuter
      3. Förvaras i kylskåp vid 2-8 ° C i upp till en månad

        Notera: Varje sputum urvalet kräver 2 ml sanering lager
    3. Kultur medier lager
      1. Into 900ml sterilt destillerat vatten och tillsätt 3.1ml glycerol och 1.25g av casitone och 5.9g av 7H9 medelstora pulver, blanda med konstant omrörning tills allt löst
      2. Autoklav vid 121-124 ° C i 15 minuter
      3. Kyl och dela den sterila medium till 4,5 ml alikvoter i sterila 16x 100 tuber mm glas för provberedning och 10.8ml alikvoter för beredning av antibiotika lösningar och intern kontroll
      4. Inkubera vid 37 ° C i 48 timmar för att verifiera sterilitet (brist på grumlighet)
      5. Förvaras vid 2-8 ° C med locket ordentligt stängda i upp till en månad

        Notera: Varje sputum urvalet kräver ett rör som innehåller 4,5 ml av 7H9 medelstora
    4. Antibiotika stamlösningar
      1. A. Isoniazid lager (8 mg / ml)
        1. Lös 20 mg isoniazid helt i 2,5 ml sterilt destillerat vatten
        2. Filter med 0.2μm spruta filter för vattenbaserade lösningsmedel
        3. Förvaras i 20μl portioner i sterila mikro centrifugering rör vid -20 ° C i upp till 6 månader

          Notera: Varje lagras 20μl delprov är tillräckligt för upp till 100 prover (inklusive spill)
      2. B. Rifampicin lager (8 mg / ml)
      1. Lös upp 20 mg rifampicin helt i 1,25 ml DMSO
      2. Tillsätt 1,25 ml sterilt destillerat vatten och blanda
      3. Filter med 0.2μm spruta filter för organiska lösningsmedel
      4. Förvaras i 20μl portioner i sterila mikrocentrifugrör vid -20 ° C i upp till 6 månader

        Notera: Varje lagras 20μl delprov är tillräckligt för upp till 100 prover (inklusive spill)
  2. Förbered fungerande lösningar
    1. Sanering brukslösning
      1. Lös upp 0,1 g NALC kristaller i varje 20 ml av sanering krävs lösning

        Notera: Varje prov behöver 2 ml sanering lösning

        Obs: Kassera NaOH-NALC sanering lösning som inte utnyttjas efter 24 timmar som NALC förlorar sin mucolytic aktivitet över tid
    2. Kultur medier brukslösning
      1. Ställ ut:
        1. 1 rör med 7H9 medium för varje sputum prov som ska bearbetas, plus ett extra rör för varje platta (för den negativa kontrollen kolumn)
        2. 2 tuber med 7H9 medium för positiva kontroller (3 om monoresistant stammar används)
        3. 1-2 rör med 10.8ml 7H9 för antibiotika beredning av lösningar
      2. Lägg 0.5ml OADC till 4,5 ml av 7H9 i varje provrör
      3. Lägg till 1,2 ml OADC till rör med 10.8ml 7H9
      4. Avsätt 2 rör med 5ml 7H9-OADC för positiva kontroller och rör (s) med 12ml 7H9-OADC att användas för antibiotika beredning av lösningar (dessa kräver inte panta)
      5. Bered Panta och lägga till 0,1 ml till varje provrör och den negativa kontrollen rören (7H9-OADC-Panta: total volym = 5.1ml)

        Notera: Komplett medium med Panta (7H9-OADC-Panta) används för sputum prover och negativa kontroller, använda 7H9-OADC utan Panta för positiva kontroller och antibiotika beredning av lösningar
    3. Antibiotika fungerar lösningar
      1. 1. Se figur 1 för steg för att göra antibiotika brukslösning i oanvänt 24-brunnar

        Obs: För korrekt känslighet resultat, den sista antibiotikakoncentrationer är kritiska. Följande procedur är lämplig för laboratories utrustad med mikropipetter. Om mikropipetter inte finns tillgängliga, kan tuberkulin sprutor användas med en annan serie spädningar som beskrivs i användarhandboken bilaga 3 till modsperu.org

        Obs: Använd inte frysas eller återanvändning antibiotika arbetar eller lösningar materiel så läkemedlets aktivitet kan gå förlorad Kassera alla oanvända antibiotika lösningar i slutet av behandlingen dagen Figur 1.. Göra ett antibiotikum fungerande lösningar (från User Guide på modsperu.org)
  3. Sputum prov och platta beredning
    1. Sanering
      1. Placera 2 ml sputum provet i ett 15 ml centrifugrör (om än mindre, fyll upp till 2 ml med fosfatbuffert, om mer, använd endast 2 ml)
      2. Tillsätt 2 ml NaOH-NALC-lösning
      3. Cap tuben väl och vortexa i 20 sekunder, vänd röret för att säkerställa NaOH-NALC lösning kontakter hela insidan av röret och locket
      4. Låt stå i minst 15 minuter - kan förlänga med några minuter om provet är speciellt trögflytande. För att undvika över behandlingen, inte bör överstiga 20 minuter
      5. Fyll röret till 14ml med fosfatbuffert (pH 6,8) för att neutralisera alkali och avsluta sanering processen och blanda väl genom att vända röret 4 gånger
      6. Centrifugera vid 3000 g under 15 minuter (se bilaga 2 i Användarhandbok på modsperu.org för ekvationen rotationer per minut krävs för att nå 3000 g)
      7. Häll försiktigt av supernatanten i ett flytande avfall behållare med 10% natriumhypoklorit eller annat lämpligt desinfektionsmedel och behålla pellets
    2. Beredning av slutligt prov fjädring och backup
      1. Använda 7H9-OADC-Panta (från röret som innehåller 5.1ml) resuspendera provet pelleten i en total volym på 2 ml i centrifugeringsröret med en pasteurpipett, blanda väl
      2. Ta 1 ml prov fjädring och förvara i en mikrocentrifugrör vid 2-8 ° C som en backup
      3. Lägg den andra 1 ml prov fjädring till röret med de återstående 7H9-OADC-Panta, blanda väl. Detta är det slutliga provet lösningen är färdig för plätering
    3. Placering prov suspensioner i 24-brunnar
      1. Placera 900μl av det slutliga provet suspensionen i var och en av fyra brunnar i en kolumn i 24-brunnar
      2. Upprepa med ytterligare prover tills alla kolumner av plattan, utom kolumn 3, fyllda (eller tills alla prover är pläterade)
      3. Plats 900μl av 7H9-OADC medium utan provet i 4 brunnar kolumn 3 i varje prov platta (negativ intern kontroll)
    4. Lägga antibiotika till prov
      1. Med hjälp av en flerkanals pipett försiktigt fylla 4 tips med 100μl från brunnarna med 7H9-OADC och antibiotika fungerande lösningar (kolumn 2 i antibiotiska utspädning plåt-se figur 1)
      2. Tillsätt 100μl alikvoter till kolumn 1 brunnar med 900μl prov lösningar utan att röra platta eller prov
      3. Upprepa tills alla kolumner har fått ytterligare 100μl av medium (drogfri brunnar) eller antibiotika lösningar (inklusive negativ kontroll kolumn 3)
      4. Stäng plattan med locket och lägg i en förslutningsbar polyeten (Ziplock) väska och packning (väskan är inte öppnas igen från denna punkt och framåt)
      5. Inkubera vid 37 ° C (CO 2 anrikning är inte nödvändigt)
  4. Kvalitetskontroll
    1. Negativa kontroller körs på varje platta. Förekomsten av någon tillväxt i någon av brunnarna i den negativa kontrollen kolumnen anger korskontaminering, alltså hela plattan måste kasseras och proverna igen klädd.
    2. Positiva kontroller körs på en separat tallrik vid slutet av dagen. En helt drog-känsliga stammar körs i en kolumn och en stam resistent mot INH och RIF körs i en annan kolumn. Om det finns oro för att köra ett MDR stam, både en INH monoresistant stam och en RIF monoresistant stam kan köras i stället för den känsliga och MDR stammar. Alla positiva kontrollerna bör ha tillväxt i drogfria brunnar för att visa att medierna stödja tillväxt. För att visa att läkemedlet koncentrationerna är korrekta, bör den känsliga stammen växer inte i INH eller RIF brunnar, men MDR stammen ska växa också växer i INH och RIF brunnar.
  5. Plate läsning
    1. Med dagen för bordläggning som "dag 0", plattan läsning startar på dag 5, och om negativ dag 5 läsning sker varje dag (eller varannan dag beroende på arbetsbelastning) fram till dag 14 och därefter var 2-3 dagar från dag 15 -21. Plattorna undersöks på ettinverterat ljusmikroskop med 10x objektiv
    2. En positiv kultur är en där det finns två eller flera kolonibildande enheter (> 2 CFU) i både drogfri brunnar. Tidig mykobakteriers tillväxt ser ut som små böjda kommatecken eller spiraler (dag 5-9). Colony bildandet fortskrider vanligen "sladdar" eller "trassel" (se bilden bibliotek på modsperu.org)
    3. På dagen en kultur som är positivt med 2 drogfria brunnar, läkemedlet som innehåller brunnar bör läsas. Någon tillväxt i närvaro av ett läkemedel visar motstånd mot att narkotika.

      Obs: Om värdet av läkemedlet som innehåller brunnar sker> en vecka efter en positiv kultur noteras i drogfria brunnar kan det inte representera motståndet som genombrott tillväxt ibland ses
    4. Prover som inte är positiva vid dag 21 betraktas som negativa kulturer
    5. Grumling av brunnarna är ett resultat av smitta igenväxning, medan mykobakteriers tillväxt inte leder till grumling
    6. Efter avslutad 21 dagar kulturer kan kasseras. Kulturer kvar i den förseglade påsar och placeras i autoklav påsar och autoklaveras vid 121-124 ° C i 45-60 minuter

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Försvarsministerierna analysen riktar sig till begränsade resurser inställningar. För första gången, ger MODS möjligheten för snabb flytande kultur upptäckt av tuberkulos och multiresistent tuberkulos till begränsade resurser inställningar på strax under $ 3 per test. MODS är en icke-patentskyddad, iterativ metod och MODS community är alltid intresserade av förbättringar som andra laboratorier har lyckats göra.

Ett återkommande bekymmer är biosäkerhet av flytande mediekulturen av tuberkulos eftersom vätska kan spillts eller aerosoliserade. Vi tror att MODS analysen är mer BioSafe än någon analys som involverade indirekt drog resistensbestämning eftersom indirekta drog resistensbestämning innebär manipulering av mycket koncentrerade lösningar av mykobakterier med åtföljande risk för spill och aerosolization, i kontrast, MODS helt enkelt innebär inympning av en sputum provet i en tallrik, varefter plattan är förseglad i en plastpåse och aldrig öppnade. Detta stöds av uppgifter från Korea (Kim 2007) som visade att de hygieniska riskerna för laboratoriet arbetstagare som pläterade ut sputum prover utan att göra läkemedelsrelaterade resistensbestämning inte större än i arbetare gör mikroskopi sputum cellprov, däremot de som gör narkotikarelaterade resistensbestämning hade mycket bättre anställningsvillkor risk för tuberkulos.

Vi rekommenderar starkt att ingen av dessa förfaranden skall genomföras utan att lämpliga försiktighetsåtgärder för laboratorie-arbetare. Detta inkluderar N-95 masker för personligt andningsskydd, en klass 2 biologiska säkerhetsskåp med utmattade luft filtreras genom HEPA-filter, och ett lås på laboratoriet dörren för att stoppa turbulens luftflöde medan prover manipuleras.

Standardrutiner för bearbetning extrapulmonell prover, ett bildbibliotek av Mycobacterium tubercuclosis och andra mykobakterier och bakterier och svampar kontamination, ett rekommenderad kvalitetssäkring strategi, ett förfarande för ackreditering av laboratorier för att börja använda mods, och en FAQ blad finns på modsperu.org

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi vill tacka för Sean Fitzwater och Carmen Giannina Luna Colombo för tuberkulos tillväxt tidsförlopp video segmentet. Vi tackar Marty Roper för hennes grundliga och bra feedback under redigering och medförfattare till användarguiden, som det nu gällande protokollet togs mestadels ordagrant. Produktionen av denna video har finansierats av NIH / Fogarty International Center http://www.fic.nih.gov/ David AJ Moore bidragit som en Wellcome Trust Clinical Research Fellow i tropisk medicin och docent i infektionssjukdomar vid Imperial College London (Fellowship utmärkelse nummer 078067/Z/05). Mark F. Brady bidragit som en NIH / Fogarty International Center Research Fellow.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Refrigerator/ freezer Equipment to store pre-prepared broth and antibiotic stocks
Vortex Equipment to aid sputum decontamination
Centrifuge Equipment for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; d–s not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed)
Incubator (37 degree C) Equipment for culture; need not be CO2 enriched
Inverted light microscope Microscope to read MODS plates
Autoclave Equipment to sterilize media, PBS and used plates
Balance Equipment to weigh isoniazid, rifampicin and NALC
Middlebrook 7H9 broth (Difco) Reagent Fisher Scientific DF0713-17-9 500gr/bottle; culture media base
Casitone (pancreatic digest casein) Reagent Fisher Scientific DF0259‐17‐9 500gr/bottle; culture media base
Glycerol (glycerin) lyophilized Reagent Sigma-Aldrich G‐33‐500 500ml/bottle; culture media base
PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) Reagent Fisher Scientific B4345114 6 bottles/pack; antibiotic media supplement
OADC (Middlebrook OADC enrichment BD) Reagent Fisher Scientific B11886 10 x 20ml/pack; nutritional media supplement
Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max) Reagent Sigma-Aldrich D-2650 100ml/bottle; to prepare rifampicin stock
Antibiotic stocks: isoniazid Reagent Sigma-Aldrich I-3377 50gr/bottle; direct susceptibility testing
Antibiotic stocks: rifampicin Reagent Sigma-Aldrich R-3501 1gr/bottle; direct susceptibility testing
Sodium hydroxide (pellets) Reagent Sigma-Aldrich 221465 500gr/bottle; sputum decontamination
Sodium citrate (trisodium salt dihydrate) Reagent Sigma-Aldrich S-4641 500gr/bottle; sputum decontamination
N-acetyl-L-cysteine Reagent Sigma-Aldrich A-7250 50gr/bottle; sputum decontamination
Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4 Reagent Sigma-Aldrich P0662 500gr/bottle; sputum decontamination
Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4 Reagent Sigma-Aldrich S0876 500gr/bottle; sputum decontamination
Sodium hypochlorite Reagent household bleach to discard contaminated waste
15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35‐2096) Consumable Fisher Scientific 14‐959‐49B 500ea/case; for sputum decontamination and concentration
24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047) Consumable Fisher Scientific 08-772-1 50 plates/case; for culture and reading
Sealable polythene bags 6 X 6 “ (ziplock) Consumable for biosecurity to contain 24 well plate
Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm) Consumable VWR international 47729-583 500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth
Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml) Consumable Fisher Scientific 05‐669‐22 1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks
0.22μm filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue Consumable Fisher Scientific SLGL 025 OS 50 units/case; to filter antibiotic stocks
0.22μm filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow Consumable Fisher Scientific SLGV 033 RS 50 units/case; to filter antibiotic stocks
Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9″ Consumable Fisher Scientific 13‐678‐20C 720ea/case; to mix PANTA with media mix
Aerosol barrier tips 1000‐1300μl Consumable Fisher Scientific 02‐707‐51 1000ea/pk; to dispense media into plate
USA Scientific Tips One 1‐200μl yellow tips Consumable Fisher Scientific 1111‐0006 1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arias, M. Clinical evaluation of the microscopic-observation drug-susceptibility assay for detection of tuberculosis. Clin Infect Dis. 44, 674-674 (2007).
  2. Caviedes, L. Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures. The Tuberculosis Working Group in Peru. J Clin Microbiol. 38, 1203-1203 (2000).
  3. Caviedes, L., Moore, D. A. Introducing MODS: a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis. Indian J Med Microbiol. 25, 87-87 (2007).
  4. Caws, M. Evaluation of the MODS culture technique for the diagnosis of tuberculous meningitis. PLoS ONE. 2, e1173-e1173 (2007).
  5. Ejigu, G. S. Microscopic-observation drug susceptibility assay provides rapid and reliable identification of MDR-TB. Int J Tuberc Lung Dis. 12, 332-332 (2008).
  6. Kim, S. J. Risk of occupational tuberculosis in National Tuberculosis Programme laboratories in Korea. Int J Tuberc Lung Dis. 11, 138-138 (2007).
  7. Mello, F. C. Clinical evaluation of the microscopic observation drug susceptibility assay for detection of Mycobacterium tuberculosis resistance to isoniazid or rifampin. J Clin Microbiol. 45, 3387-3387 (2007).
  8. Moore, D. A. Future prospects for the MODS assay in multidrug-resistant tuberculosis diagnosis. Future Microbiol. 2, 97-97 (2007).
  9. Moore, D. A. Infrequent MODS TB culture cross-contamination in a high-burden resource-poor setting. Diagn Microbiol Infect Dis. 56, 35-35 (2006).
  10. Moore, D. A. Microscopic-observation drug-susceptibility assay for the diagnosis of TB. N Engl J Med. 355, 1539-1539 (2006).
  11. Moore, D. A. Microscopic observation drug susceptibility assay, a rapid, reliable diagnostic test for multidrug-resistant tuberculosis suitable for use in resource-poor settings. J Clin Microbiol. 42, 4432-4432 (2004).
  12. Moore, D. A., Roper, M. H. Diagnosis of smear-negative tuberculosis in people with HIV/AIDS. Lancet. 370, 1033-1033 (2007).
  13. Oberhelman, R. A. Improved recovery of Mycobacterium tuberculosis from children using the microscopic observation drug susceptibility method. Pediatrics. 118, e100-e100 (2006).
  14. Palomino, J. C., Martin, A., Portaels, F. MODS assay for the diagnosis of TB. N Engl J Med. 356, 188-189 (2007).
  15. Park, W. G., Bishai, W. R., Chaisson, R. E., Dorman, S. E. Performance of the microscopic observation drug susceptibility assay in drug susceptibility testing for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 40, 4750-4750 (2002).
  16. Shiferaw, G. Evaluation of microscopic observation drug susceptibility assay for detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 45, 1093-1093 (2007).
  17. Tovar, M. Improved diagnosis of pleural tuberculosis using the microscopic- observation drug-susceptibility technique. Clin Infect Dis. 46, 909-909 (2008).
  18. Vargas, D. Diagnosis of sputum-scarce HIV-associated pulmonary tuberculosis in Lima, Peru. Lancet. 365, 150-150 (2005).

Tags

Mikrobiologi 18 tuberkulos tbc multiresistent tuberkulos MDRTB kultur diagnostiska
Försvarsministerierna metoden för diagnos av tuberkulos och multiresistent tuberkulos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brady, M. F., Coronel, J., Gilman,… More

Brady, M. F., Coronel, J., Gilman, R. H., Moore, D. A. The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis. J. Vis. Exp. (18), e845, doi:10.3791/845 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter