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Biology

O método MODS para o diagnóstico da tuberculose e da tuberculose resistente a múltiplas drogas

Published: August 11, 2008 doi: 10.3791/845
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1The Warren Alpert Medical School of Brown University, 2Laboratorio de Investigacion de Enfermedades Infecciosas, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 3Department of International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 4Wellcome Trust Centre for Clinical Tropical Medicine, Imperial College London

Summary

A observação microscópica de drogas susceptibilidade-ensaio (MODS) é uma low-cost, low-tech ferramenta de alto desempenho para detecção de tuberculose (TB) e tuberculose multirresistente (TBMR). Este vídeo descreve o MODS líquido método de cultura de mídia.

Abstract

Pacientes com tuberculose pulmonar ativa (TB) 15/10 infectar outras pessoas por ano, tornando o diagnóstico de TB ativa essencial para tanto a cura do paciente e prevenção de novas infecções. Além disso, o surgimento da tuberculose resistente a múltiplas drogas (TBMR) significa que a detecção da resistência às drogas é necessário para impedir a disseminação de cepas resistentes. A observação microscópica de drogas susceptibilidade-ensaio (MODS) é uma low-cost, low-tech ferramenta de alto desempenho para detecção de TB e da TBMR. O ensaio MODS é baseada em três princípios: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) cresce mais rapidamente em meios líquidos do que em meios sólidos 2) o crescimento MTB microscópicas podem ser detectadas anteriormente em meios líquidos de esperar que o aspecto macroscópico das colônias em meios sólidos e que o crescimento é característica de MTB, permitindo que ele seja distinguido de contaminação micobactérias ou fungos ou bactérias atípicas 3) as drogas isoniazida e rifampicina pode ser incorporada no ensaio MODS para permitir a detecção direta simultânea de TBMR, eliminando a necessidade de subcultura para executar um teste de sensibilidade indireto da droga. Concorrentes diagnósticos atuais são dificultados pela baixa sensibilidade com baciloscopia, longos atrasos até o diagnóstico com a cultura meios sólidos, com custos proibitivos de métodos existentes líquido meios de cultura, ea necessidade de fazer subcultura para testes indiretos de drogas susceptibilidade para detectar TBMR. Em contraste, o não-proprietário método MODS tem uma alta sensibilidade para TB e da TBMR, é um método de cultura relativamente rápido, oferece testes de sensibilidade simultânea de drogas para TBMR, e é acessível a locais de recursos limitados em pouco menos de 3 dólares para os testes de TB e TBMR.

Protocol

  1. Preparar soluções estoque
    1. Fosfato de estoque regulador
      1. Misture 950ml de solução de sódio dibásico (9.47g de fosfato de sódio dibásico dissolvido em água destilada 1000ml) com 950ml de potássio solução de fosfato monobásico (9.07g de potássio fosfato monobásico dissolvido em água destilada 1000ml) e agitar; retivesses 50ml de cada solução para ajustar pH se necessário
      2. Ajustar o pH para 6,8 ± 0,2: adicionar fosfato de sódio dibásico solução para elevar o pH, adicione a solução de fosfato de potássio monobásico de baixar o pH
      3. Autoclave a 121-124 ° C por 15 minutos para esterilizar
      4. Placa de uma alíquota de 100μl da solução tampão de fosfato em meio agar nutriente em uma placa de Petri e incubar a 37 ° C por 48 horas para confirmar a esterilidade
      5. Guarde na geladeira a 2-8 ° C por até um mês

        Nota: Cada amostra de escarro requer 10ml de solução tampão fosfato
    2. Ações de descontaminação
      1. Combine volumes iguais de solução de hidróxido de sódio (8,0 g de hidróxido de sódio dissolvido em água destilada estéril 200ml) e solução de citrato de sódio (5,8 g de citrato de sódio em água destilada estéril 200ml destilada)
      2. Misture e autoclave a 121-124 ° C por 15 minutos
      3. Guarde na geladeira a 2-8 ° C por até um mês

        Nota: Cada amostra de escarro requer 2ml de ações de descontaminação
    3. Cultura de ações de mídia
      1. Em 900ml de água destilada estéril, adicionar 3.1ml de glicerol e 1,25 g de casitone e 5,9 g de pó meio 7H9 e misturar com agitação constante até completamente dissolvido
      2. Autoclave a 121-124 ° C por 15 minutos
      3. Esfriar e dividir o meio estéril em alíquotas 4.5ml em estéril 16x 100 tubos de vidro milímetros para preparação de amostras, e 10.8ml alíquotas para a preparação de soluções de antibióticos e de controles internos
      4. Incubar a 37 ° C por 48 horas para verificar a esterilidade (ausência de turbidez)
      5. Armazenar de 2-8 ° C com tampa bem fechado por até um mês

        Nota: Cada amostra de escarro requer um tubo contendo 4,5 ml de meio 7H9
    4. Antibiótico soluções estoque
      1. A. Isoniazida estoque (8 mg / ml)
        1. Dissolver 20 mg de isoniazida completamente em água destilada estéril, 2,5 ml
        2. Filtro com filtro de seringa de 0,2 Hm para solvente aquoso
        3. Loja em alíquotas 20μl em tubos de centrifugação estéril micro a -20 ° C por até 6 meses

          Nota: Cada alíquota armazenada 20μl é suficiente para até 100 amostras (incluindo o desperdício)
      2. B. A rifampicina estoque (8 mg / ml)
      1. Dissolver 20mg rifampicina completamente em 1.25ml DMSO
      2. Adicionar 1.25ml água destilada estéril e misturar
      3. Filtro com filtro de seringa de 0,2 Hm de solvente orgânico
      4. Loja em alíquotas 20μl em tubos de microcentrífuga estéril a -20 ° C por até 6 meses

        Nota: Cada alíquota armazenada 20μl é suficiente para até 100 amostras (incluindo o desperdício)
  2. Prepare soluções de trabalho
    1. Solução de descontaminação de trabalho
      1. Dissolver 0,1 g de cristais de NALC em cada 20ml de solução de descontaminação requerido

        Nota: Cada amostra necessidades 2ml de solução de descontaminação

        Nota: Eliminar qualquer solução de descontaminação NaOH-NALC que permanece não utilizado após 24 horas, como NALC perde a sua atividade ao longo do tempo mucolítico
    2. Solução de meios de cultura de trabalho
      1. Estabelecidos:
        1. 1 tubo com meio 7H9 para cada amostra de escarro para ser processado, além de um tubo adicional para cada placa (para a coluna controle negativo)
        2. 2 tubos de meio 7H9 para os controles positivo (3 se cepas monoresistant são usados)
        3. 02/01 tubos com 7H9 10.8ml para a preparação de solução antibiótica
      2. Adicionar 0,5 ml OADC ao 4.5ml de 7H9 em cada tubo de amostra
      3. Adicionar OADC 1,2 ml para tubos com 7H9 10.8ml
      4. Separe dois tubos com 5ml 7H9-OADC os controles positivos, e tubo (s) com 12ml 7H9-OADC a ser utilizado para a preparação de solução antibiótica (estes não requerem PANTA)
      5. PANTA reconstituir e adicionar 0,1 ml para cada tubo de amostra e os tubos de controle negativo (7H9-OADC-PANTA: volume total = 5.1ml)

        Nota: médio completo com PANTA (7H9-OADC-PANTA) é usado para amostras de escarro e controles negativos; use 7H9-OADC sem PANTA de controlos positivos e para a preparação de solução antibiótica
    3. Antibiótico soluções de trabalho
      1. 1. Veja a Figura 1 para as etapas para tornar a solução antibiótica trabalhando em uma placa de 24 poços não utilizados

        Nota: Para obter resultados precisos de suscetibilidade, as concentrações finais de antibióticos são críticos. O procedimento a seguir é adequado para laboratories equipado com micropipetas. Se micropipetas não estão disponíveis, seringas de tuberculina pode ser usado com uma série de diluições diferentes descritos no Guia do Usuário Apêndice 3 a modsperu.org

        Nota: Não volte a congelar ou re-utilização de trabalho antibióticos ou soluções de ações como a atividade das drogas podem ser perdidos Descartar todas as soluções não utilizado antibiótico no final do dia de processamento Figura 1.. Tornando as soluções de antibióticos de trabalho (de Guia do Usuário no modsperu.org)
  3. Amostra de escarro e placa de preparação
    1. Descontaminação
      1. 2ml lugar de amostra de escarro em um tubo de centrífuga de 15ml (se for inferior, compõem a 2ml com tampão fosfato; se mais, use apenas 2ml)
      2. Adicionar 2 ml de solução NaOH-NALC
      3. Tubo de tampa bem e vortex por 20 segundos; inverter tubo para garantir contatos NaOH-NALC solução a superfície interior do tubo inteiro e tampa
      4. Deixe repousar por um mínimo de 15 minutos - pode prolongar por alguns minutos se a amostra é particularmente viscoso. Para evitar o excesso de tratamento, não deve exceder 20 minutos
      5. Encha o tubo de 14ml com tampão fosfato (pH 6,8) para neutralizar alcalinos e encerrar o processo de descontaminação, e misture bem, vire o tubo 4 vezes
      6. Centrifugar a 3000 g por 15 minutos (ver Apêndice 2 no Guia do Usuário no modsperu.org para a equação de rotações por minuto necessário para atingir 3000 g)
      7. Deitar fora o sobrenadante cuidadosamente em um recipiente de resíduos líquidos com hipoclorito de sódio 10% ou outro desinfetante adequado e manter o pellet
    2. Preparação da suspensão amostra final e backup
      1. Utilizando-7H9-OADC PANTA (a partir do tubo contendo 5.1ml), ressuspender o sedimento em amostra de um volume total de 2ml no tubo de ensaio com uma pipeta Pasteur, misture bem
      2. Retire 1ml de suspensão da amostra e armazenar em um tubo de microcentrífuga de 2-8 ° C como um backup
      3. Adicione o segundo 1ml de suspensão de amostra para o tubo com os restantes 7H9-OADC-PANTA; misture bem. Esta é a solução da amostra final pronto para revestimento
    3. Colocando suspensões amostra em 24 poços da placa
      1. 900μl lugar da suspensão amostra final em cada um dos quatro poços de uma coluna na placa de 24 poços
      2. Repita com amostras adicionais até que todas as colunas da placa, com exceção da coluna 3, são preenchidos (ou até que todas as amostras são banhados)
      3. 900μl lugar de 7H9-OADC meio sem amostra na 4 poços da coluna 3 de cada placa de amostra (negativo controles internos)
    4. Adição de antibióticos para amostras
      1. Com uma pipeta multi-canal, preencha cuidadosamente quatro pontas com 100μl dos poços com 7H9-OADC e antibiótico soluções de trabalho (Coluna 2 na diluição de antibióticos placa-ver Figura 1)
      2. Adicione o alíquotas 100μl para a coluna 1 poços com soluções amostra 900μl sem tocar placa ou amostra
      3. Repita até que todas as colunas receberam o adicional de 100μl médio (livre de drogas poços) ou soluções de antibiótico (incluindo coluna de controle negativo 3)
      4. Feche a placa com a sua tampa e coloque em um saco de polietileno lacrado (Ziplock) e selo (saco não for aberto novamente a partir deste ponto)
      5. Incubar a 37 ° C (CO 2 de enriquecimento não é necessário)
  4. Controle de qualidade
    1. Controles negativos são executados em cada placa. A presença de qualquer crescimento em qualquer um dos poços na coluna de controle negativo indica a contaminação cruzada, portanto, toda a placa deve ser descartado e as amostras re-plated.
    2. Os controlos positivos são executados em uma placa separada no final do dia. Uma cepa totalmente drogas suscetíveis é executado em uma coluna e uma cepa resistente à INH e RIF é executado em outra coluna. Se há preocupação sobre a execução de uma cepa MDR, tanto a tensão um monoresistant INH e RIF monoresistant uma cepa pode ser executado no lugar das cepas sensíveis e MDR. Todos os controles positivos deve ter crescimento nos poços livre de drogas para demonstrar que o crescimento apoio da mídia. Para demonstrar que as concentrações da droga estão corretas, a cepa suscetível não deve crescer no INH ou poços RIF, mas a cepa MDR deve crescer também crescer no INH e RIF poços.
  5. Leitura da placa
    1. Com o dia do chapeamento como "dia 0", a leitura da placa começa no dia 5, e se negativo no dia 5 de leitura é feito a cada dia (ou dias alternados, dependendo da carga de trabalho) até o dia 14 e depois a cada 2-3 dias a partir de dia 15 -21. Placas são examinadas em ummicroscópio de luz invertida, com o objetivo de 10x
    2. A cultura positiva é aquela em que há duas ou mais unidades formadoras de colônia (> 2 CFU) em AMBAS as livre de drogas poços. Micobactérias de crescimento no início se parece com pequenas vírgulas curvas ou espirais (dia 09/05). Formação de colônias geralmente progride para "cordas" ou "emaranhados" (ver imagem na biblioteca modsperu.org)
    3. No dia em que uma cultura é positiva na 2 livre de drogas poços, os poços de drogas que contêm deve ser lido. Qualquer crescimento na presença de uma droga indica resistência a essa droga.

      Nota: Se a leitura dos poços de drogas que contêm é feito> uma semana depois de uma cultura positiva é observado nos poços livre de drogas, isso não pode representar a resistência como break-through crescimento é visto ocasionalmente
    4. As amostras que não são positivos por Dia 21 são consideradas culturas negativas
    5. Nebulosidade dos poços é resultado de crescimento excessivo de contaminação, enquanto que o crescimento de micobactérias não resulta na nebulosidade
    6. Após a conclusão de 21 dias as culturas podem ser descartados. Culturas permanecem em seus sacos fechados e são colocados em sacos de autoclave e autoclavados a 121-124 ° C durante 45-60 minutos

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Discussion

O ensaio MODS é destinado a ambientes de recursos limitados. Pela primeira vez, MODS traz a capacidade para a detecção rápida de cultura líquido de tuberculose multirresistente e tuberculose resistente a ambientes de recursos limitados em pouco menos de 3 dólares por teste. MODS é um não-proprietário, a metodologia iterativa, ea comunidade MODS está sempre interessada em melhorias que outros laboratórios têm conseguido fazer.

Uma preocupação recorrente é a biossegurança da cultura de mídia líquida da tuberculose, porque os líquidos podem ser derramado ou aerossol. Acreditamos que o ensaio MODS é mais do que qualquer Biosafe ensaio que envolveu testes de sensibilidade indireto da droga, porque os testes de sensibilidade indireto de drogas envolve a manipulação de soluções altamente concentradas de micobactérias com os respectivos riscos de derrame e aerosolization, em contraste, MODS simplesmente envolve a inoculação de uma amostra de escarro em uma placa, após o que a placa é selada dentro de um saco plástico e nunca mais abriu. Isto é suportado por dados da Coréia (Kim 2007) que mostrou que o risco ocupacional para trabalhadores de laboratório que fora banhado amostras de escarro sem fazer testes de susceptibilidade de drogas não era maior do que nos trabalhadores a fazer a baciloscopia de escarro, em contraste, aqueles que fazem por drogas testes de susceptibilidade tinha muito maior risco ocupacional para tuberculose.

Recomendamos fortemente que nenhum desses procedimentos é realizado sem as devidas precauções para os trabalhadores do laboratório. Isto inclui N-95 máscaras para proteção respiratória pessoal, uma classe 2 cabines de segurança biológica com ar exausto filtrada através de filtros HEPA, e uma fechadura na porta do laboratório para parar a turbulência do fluxo de ar, enquanto as amostras estão sendo manipulados.

Procedimentos operacionais padrão para o processamento de amostras extrapulmonares, uma biblioteca de fotos do mycobacterium tubercuclosis e contaminação micobactérias e outras bactérias e fungos, uma estratégia de garantia de qualidade recomendada, um procedimento de acreditação de laboratórios para começar a usar MODS, e uma folha de FAQ estão disponíveis em modsperu.org

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Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer Sean Fitzwater e Carmen Giannina Luna Colombo para o segmento de vídeo tuberculose crescimento lapso de tempo. Agradecemos a Marty Roper para ela um feedback completo e excelente durante a edição e co-autoria o Guia do Usuário, a partir do qual o actual protocolo foi tomada principalmente verbatim. Produção deste vídeo foi financiado pelo NIH / Fogarty International Center http://www.fic.nih.gov/ David AJ Moore contribuiu como Research Fellow Wellcome Trust Clínica em Medicina Tropical e Reader em Doenças Infecciosas do Imperial College London (Sociedade número prêmio 078067/Z/05). Mark F. Brady contribuiu como um NIH / Fogarty Fellow Research International Center.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Refrigerator/ freezer Equipment to store pre-prepared broth and antibiotic stocks
Vortex Equipment to aid sputum decontamination
Centrifuge Equipment for sputum concentration; capable of reaching 3000 g; d–s not need to be refrigerated, but MUST be biosafe (buckets can be sealed)
Incubator (37 degree C) Equipment for culture; need not be CO2 enriched
Inverted light microscope Microscope to read MODS plates
Autoclave Equipment to sterilize media, PBS and used plates
Balance Equipment to weigh isoniazid, rifampicin and NALC
Middlebrook 7H9 broth (Difco) Reagent Fisher Scientific DF0713-17-9 500gr/bottle; culture media base
Casitone (pancreatic digest casein) Reagent Fisher Scientific DF0259‐17‐9 500gr/bottle; culture media base
Glycerol (glycerin) lyophilized Reagent Sigma-Aldrich G‐33‐500 500ml/bottle; culture media base
PANTA (Antibiotic mixture lyophilized BD) Reagent Fisher Scientific B4345114 6 bottles/pack; antibiotic media supplement
OADC (Middlebrook OADC enrichment BD) Reagent Fisher Scientific B11886 10 x 20ml/pack; nutritional media supplement
Dimethyl sulphoxide (Hibri-Max) Reagent Sigma-Aldrich D-2650 100ml/bottle; to prepare rifampicin stock
Antibiotic stocks: isoniazid Reagent Sigma-Aldrich I-3377 50gr/bottle; direct susceptibility testing
Antibiotic stocks: rifampicin Reagent Sigma-Aldrich R-3501 1gr/bottle; direct susceptibility testing
Sodium hydroxide (pellets) Reagent Sigma-Aldrich 221465 500gr/bottle; sputum decontamination
Sodium citrate (trisodium salt dihydrate) Reagent Sigma-Aldrich S-4641 500gr/bottle; sputum decontamination
N-acetyl-L-cysteine Reagent Sigma-Aldrich A-7250 50gr/bottle; sputum decontamination
Potassium Phosphate Monobasic crystal. KH2PO4 Reagent Sigma-Aldrich P0662 500gr/bottle; sputum decontamination
Sodium Phosphate Dibasic, anhydrous. Na2HPO4 Reagent Sigma-Aldrich S0876 500gr/bottle; sputum decontamination
Sodium hypochlorite Reagent household bleach to discard contaminated waste
15ml centrifuge tubes (polypropylene 15ml Falcon 35‐2096) Consumable Fisher Scientific 14‐959‐49B 500ea/case; for sputum decontamination and concentration
24 well plates (Plates Tissue 24 wells BD Falcon 35‐3047) Consumable Fisher Scientific 08-772-1 50 plates/case; for culture and reading
Sealable polythene bags 6 X 6 “ (ziplock) Consumable for biosecurity to contain 24 well plate
Glass tubes with lid (16 x 100mm and 18 x 145mm) Consumable VWR international 47729-583 500 tubes/case; to store aliquots of prepared broth
Screw cap microcentrifuge tubes (1.5ml) Consumable Fisher Scientific 05‐669‐22 1000ea/case; to store aliquots of antibiotic stocks
0.22μm filters (aqueous solvents) Syringe filter Millex blue Consumable Fisher Scientific SLGL 025 OS 50 units/case; to filter antibiotic stocks
0.22μm filters (organic solvents) Syringe filter Millex yellow Consumable Fisher Scientific SLGV 033 RS 50 units/case; to filter antibiotic stocks
Disposable Pasteur pipettes borosilicate glass 9″ Consumable Fisher Scientific 13‐678‐20C 720ea/case; to mix PANTA with media mix
Aerosol barrier tips 1000‐1300μl Consumable Fisher Scientific 02‐707‐51 1000ea/pk; to dispense media into plate
USA Scientific Tips One 1‐200μl yellow tips Consumable Fisher Scientific 1111‐0006 1000 tips/bag; to dilute antibiotic stocks

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References

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