Summary
טכניקה מהירה להדמיה של גידול בתאי שמרים משותקת, מיושם כאן לכתבים פלורסנט בבית לוקוסים שקט ההזדווגות HML ו HMR
Abstract
אנו מציגים כאן טכניקה פשוטה, מהירה, גמישה מאוד עבור immobilization ויזואליזציה של תאים שמרים גדל מיקרוסקופיה epifluorescence. השיטה מתאימה במידה שווה עבור להדמיה של אוכלוסיות שמרים סטטי, או קורסים ניסויים זמן עד עשר שעות אורך. מיקרוסקופיה שלי חוקר ירושה epigenetic ב לוקוסים ההזדווגות שקטה cerevisiae ס. ישנם שני לוקוסים ההזדווגות שקט, HML ו HMR, אשר בדרך כלל לא הביע כפי שהם ארוזים heterochromatin. ב השתקה sir1 רקע מוטנטים הוא נחלש כל כך מוקד יכול להיות במדינה epigenetic הביע או מושתקים, כך באוכלוסייה כולה יש ערבוב של תאים של מדינות שונות הן epigenetic HML ו HMR. מיקרוסקופיה שלי הראו כי אין קשר בין המדינה epigenetic של HML ו HMR בתא בודד. sir1 תאים stochastically הבורר מדינות epigenetic, הקמת ההשתקה על מוקד הביע בעבר או להביע מוקד השתיק בעבר. במהלך הזמן שלי מיקרוסקופיה מעקב אישי sir1 תאים וצאצאיהם להבקיע את התדירות של כל אחד מארבעת מתגים epigenetic אפשרי, ולכן יציבותה של כל אחת מהמדינות epigenetic ב sir1 תאים. ראה גם שו et al. מול. תא 2006.
Protocol
- תאים משותקת עבור מיקרוסקופיה כמובן זמן epifluorescence. שים לב כי פרוטוקול זה שימושי רק אם המטרה של עדשות המיקרוסקופ שלך נמצאות מתחת למיקרוסקופ הבמה.
- המקום התאים בריכוז הרצוי בתקשורת נוזלי על coverslip ארוכה (24x50mm בערך)
- גזור לחסום אגר בגודל הרצוי מהצלחת מדיה סינתטיים (אלה autofluorescence התחתון) ואת המקום על התאים. הנח את הצד של גוש אגר לא מטופלים על ידי פינצטה במגע עם התאים.
- לקורסים זמן קצר (עד 3 שעות), להגדיר את זה מספיק. אם התאים עוברים כאשר דמיינו על המיקרוסקופ, להקטין נפח של תאים או אזור גידול של לחסום את אגר.
- לקורסים זמן רב יותר, במקום ירידה של התקשורת נוזלי טרי על גבי לחסום את אגר, ומקום שקופיות הזכוכית על גבי לחסום את אגר. שקופיות זה מפחית התאדות דרך החלק העליון של לחסום את אגר. אם תרצה, בקצוות של גוש אגר במגע עם להחליק את מכסה יכול להיות חתום עם וזלין כדי לצמצם עוד יותר לחות. השתמשתי להגדיר עבור סרטים עד 9 שעות ארוכות, עם חלוקת תאים בשיעורים סוג בר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זוהי טכניקה מהירה שמגביל תאים שמרים תוך מתן צמיחה. יש לנו בעקבות גידול השמרים עד עשר שעות, עם השמרים הצגת בר חלוקה שיעורי ברחבי סוג הניסוי. שים לב התקנה זו מחייבת את העדשה המטרה להיות מתחת לבמה מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות פיט יוסטון יבגניה שו על כל העזרה שלהם.
References
- , Forthcoming.
