냉동 세포에서 시작 문화 : 인간 ES 세포

Summary

여기 우리는 우리의 실험실은 냉동 주식에서 색채 인간 배아의 줄기 세포 라인 문화를 시작하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

여기 우리는 우리의 실험실은 냉동 주식에서 색채 인간 배아의 줄기 세포 라인 문화를 시작하는 방법을 보여줍니다. 첫째, 약 한 1-2일 오래된 십cm 플레이트 (두) 만 조사 마우스 배아 fibroblast 피더 세포는 잔류 혈청 및 세포 파편을 제거하는 색채 미디어 씻어서이며, 다음 색채 미디어는 추가하고 셀에 평형 왼쪽 문화 인큐베이터. 장기 액체 질소 저장 또는 - 80C 냉장고에서 세포의 냉동 유리병 빨리 해동을위한 37C 물을 욕조에 공급하고 빠르게 잠수입니다. 냉동 미디어 세포 다음 유리병에서 제거와 색채 미디어의 큰 볼륨에 배치됩니다. 색채의 큰 볼륨 미디어 색채 인간 배아 줄기 세포가 구별시킬 수있는 여분의 혈청과 DMSO의 제거를 용이하게합니다. 전지는 부드럽게 정지 뽑아 버리고 다음 다음 씨앗 MEF 접시를 사용하는 신선한 색채 미디어의 작은 볼륨에서 다시 일시 중지됩니다. 그것은 부드럽게 균일하게 접시에 걸쳐 뿌려주하는 드롭 현명한 방식으로 색상 세포를 추가하여 씨앗 MEF 판을하는 것이 중요 간주됩니다. 미디어가 교체되기 전에 새로 설립 색채 문화 플레이트가 48 시간을위한 인큐베이터로 반환됩니다, 그때 이후 24 시간마다 공급합니다.

Protocol

냉동 주식에서 해동 :

1. 색상 세포를 해동하기 전에, 당신이 이미 준비 MEF 접시가 제대로 양호한 상태로 도금하고 있는지 확인합니다. 바람직한 판, 아니면 3 일 이상 오래된 하나보다 적게 사용하려고하지 마십시오. 그것은 모두 원뿔 튜브와 우물을 사용하고 사전 레이블을 권장합니다.
   
   
2. 37 ° C. 사전 따뜻한 색채 미디어 나누어지는의 색채 미디어의 각 라인에 대한 살균 원뿔 관에. -80에서 색채 유리병 / s를 제거하고 즉시 잠수함 37 ° C 물 욕조에서 튜브의 아래쪽 절반을. 세포는 80 % (왼쪽 작은 부분 냉동) 해동되기 전에는 45~60초 정도 걸릴 것입니다.
   
   
3. 신속 튜브는 층류 후드에 가지고 70 %의 알코올로 아래로 스프레이하고, 부드럽게 사전 예열 미디어의에 세포를 전송할 수 있습니다. 튜브를 스핀, 미디어를 제거하고 신선한 사전 예열 색채 미디어의 적절한 볼륨에 resuspend.
   
   
4. 당신이로 해동 것입니다 많은 우물 등에서 MEF 미디어를 대기음. 신속하게 나누어지는 사전 예열 색채 미디어 다시 접시의 각 우물에가 첨부된 MEFs을 방해하지 않도록주의하고. 후드에 따로 접시를 설정합니다. 방울이 균일하게 접시에 대한 배포하는 경우 MEFs와 마찬가지로 가장 좋은 결과를 얻을 수있다. 종자로 색상 세포가 MEFs 수 있도록 야간 37 ° C 배양기에 플레이트를 주의깊게 반환합니다. 신선한 색채 미디어 대체, ~ 48 시간 해동 후 미디어를 변경합니다.

Discussion

이 비디오에서는, 우리는 우리 연구실은 정기적으로 냉동 주식에서 색채 인간 배아의 줄기 세포 배양을 수립 방법을 보여줍니다. 이 프로세스는 DMSO 용액에서 냉동하는 경우 모든 포유 동물 세포와 함께 일반적인 사용을위한 의무입니다. 효율적인 해동 꽁꽁 얼어붙은 주식에서 색채 세포의 새로운 문화를 구축 필수적이며, 실험의 일관성을 위해 중요합니다.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml