Células ES: Cultura A partir de células congeladas

Summary

Aqui demonstramos como nosso laboratório começa uma MATIZ-tronco embrionárias humanas cultura linhagem de células de um estoque congelado.

Abstract

Aqui demonstramos como nosso laboratório começa uma MATIZ-tronco embrionárias humanas cultura linhagem de células de um estoque congelado. Primeiro, um ou dois dias placa de idade dez centímetros aproximadamente um (a dois) milhões de rato irradiadas células embrionárias alimentador de fibroblastos é lavado com a mídia MATIZ para remover soro residual e restos celulares, e então a mídia MATIZ adicionado e para a esquerda para equilibrar na célula cultura incubadora. Um frasco frozen de células de armazenamento de longo prazo de nitrogênio líquido ou um freezer-80C é originária e rapidamente imerso em banho-maria 37C para o descongelamento rápido. Células em meios de congelamento são então removidas do frasco e colocado em um grande volume de meios tons. O grande volume de tons de mídia facilita a remoção do soro em excesso e DMSO, o que pode causar MATIZ células estaminais embrionárias humanas para diferenciar. As células são delicadamente girado para fora de suspensão, e então re-suspenso em um pequeno volume de mídia fresco matizes que é então usado como semente para a placa MEF. Considera-se importante para semear a placa MEF suavemente adicionando as células matizes em queda de forma sábia para dispersá-los uniformemente em todo o prato. A placa de cultura recém-criada matizes é devolvido para a incubadora por 48 horas antes da mídia é substituído, então é alimentado a cada 24 horas depois.

Protocol

Descongele de um estoque congelados:

1. Antes de descongelamento células matizes, garantir que a placa MEF você já está devidamente preparado banhados e em boas condições. NÃO tente usar uma placa de menos de desejável, ou um que tem mais de três dias. Recomenda-se a pré-label todos os tubos cônicos e poços sendo usados.
   
   
2. Pré-aquecer media MATIZ a 37 ° C. Alíquota media MATIZ em um tubo cônico estéril para cada linha. Remover MATIZ frasco / s de -80 e imediatamente mergulhe a metade inferior do tubo em banho-maria a 37 ° C. Deve ter cerca de 45-60 segundos antes de as células são descongeladas 80% (porção pequena congelados esquerda).
   
   
3. Rapidamente trazer o tubo para a capela de fluxo laminar, lavar com álcool a 70%, e gentilmente transferência de células para a pré-aquecido mídia. Girar o tubo, remova a mídia, e ressuspender em um volume adequado de produtos frescos, a mídia pré-aquecido matizes.
   
   
4. Aspirar a mídia off MEF como poços de muitos como você vai estar em descongelamento. Rapidamente, a mídia alíquota pré-aquecido MATIZ volta em cada poço da placa, tomando cuidado para não perturbar o MEFs anexado. Colocou o prato de lado no capô. Tal como acontece com MEFs, melhores resultados são obtidos se as gotas estão uniformemente distribuídas sobre a placa. Voltar cuidadosamente a placa para a 37 ° C incubadora durante a noite para permitir que as células MATIZ semear o MEFs. Alterar media ~ 48 horas após o descongelamento, substituindo com a mídia fresco matizes.

Discussion

Neste vídeo, mostramos como nosso laboratório rotineiramente estabelece uma MATIZ embrionárias humanas cultura de células-tronco a partir de um estoque de congelados. Este processo é passível de uso geral com qualquer de células de mamíferos se congelado em uma solução de DMSO. Descongelamento eficiente é essencial para o estabelecimento de uma nova cultura de matizes células de um estoque congelado, e é importante para a consistência experimental.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml