ES خلايا الإنسان : ثقافة ابتداء من خلايا مجمدة

Summary

نحن هنا لشرح كيفية مختبرنا يبدأ الأشكال الجذعية الجنينية البشرية خلية ثقافة سطر من الأسهم المجمدة.

Abstract

نحن هنا لشرح كيفية مختبرنا يبدأ الأشكال الجذعية الجنينية البشرية خلية ثقافة سطر من الأسهم المجمدة. أولا ، يتم شطف a 1-2 اليوم وحة الطول العمر عشرة من واحد تقريبا (لاثنين) مليون المشع الليفية التغذية الماوس الجنينية خلايا الاشكال مع وسائل الاعلام لازالة الحطام وبقايا مصل الخلية ، ثم الأشكال وسائل الاعلام واليسار وأضاف أن يوازن في الخلية الثقافة الحاضنة. هو مصدر المجمدة قارورة من الخلايا على المدى الطويل من تخزين النتروجين السائل أو المجمد A - 80C وسرعان ما غرقت في حمام مائي 37C لذوبان سريع. ثم تتم إزالة الخلايا في وسائل الاعلام من تجميد القارورة ووضعها في مجلد كبير من وسائل الاعلام الأشكال. حجم كبير من الأشكال وسائل الاعلام المصل يسهل إزالة الزائدة وDMSO ، والتي يمكن أن تسبب الأشكال الخلايا الجذعية الجنينية البشرية للتمييز. هي نسج الخلايا برفق من التعليق ، ومن ثم إعادة معلقة في حجم صغير وسائل الاعلام الأشكال الجديدة التي يتم استخدامها بعد ذلك إلى البذور لوحة MEF. ويعتبر أن من المهم أن البذور لوحة MEF بإضافة بلطف خلايا الأشكال بطريقة حكيمة لتفريق قطرة بالتساوي لهم في جميع أنحاء اللوحة. يتم إرجاع الثقافة الأشكال التي أنشئت حديثا لوحة إلى حاضنة لمدة 48 ساعة قبل أن يتم استبدال وسائل الإعلام ، ثم يتم تغذية كل 24 ساعة بعد ذلك.

Protocol

ذوبان الجليد من الأسهم المجمدة :

1. قبل ذوبان الأشكال الخلايا ، وضمان مطلي بشكل صحيح لوحة MEF لديك بالفعل وعلى استعداد في حالة جيدة. DO NOT محاولة استخدام لوحة أقل من المرغوب فيه ، أو واحد هو أن أقدم من ثلاثة أيام. فمن المستحسن أن التسمية السابقة تستخدم جميع الأنابيب المخروطية والآبار.
   
   
2. قبل الدافئة الاشكال وسائل الاعلام الى 37 درجة مئوية. قسامة الأشكال وسائل الاعلام في أنبوب مخروطي معقمة في كل سطر. إزالة الأشكال فيال / ق -80 ويغرق من الفور في النصف السفلي من الأنبوب في حمام مائي 37 ° C. وينبغي أن يستغرق حوالي 45-60 ثانية قبل أن الخلايا 80 ٪ إذابة (جزء صغير مجمدة اليسار).
   
   
3. جلب بسرعة الأنبوب إلى تدفق الصفحي هود ، الرذاذ أسفل مع الكحول 70 ٪ ، ونقل الخلايا برفق إلى ما قبل تحسنت وسائل الإعلام. تدور في أنبوب ، وإزالة وسائل الإعلام ، وresuspend في حجم مناسب لالعذبة ، والأشكال وسائل الاعلام قبل تحسنت.
   
   
4. نضح قبالة الإعلام MEF من حيث العديد من الآبار كما أنك سوف تكون في الذوبان. بسرعة ، قسامة قبل تحسنت الأشكال وسائل الإعلام مرة أخرى في كل بئر من لوحة ، والحرص على عدم تعكير صفو MEFs المرفقة. تعيين لوحة جانبا في غطاء محرك السيارة. كما هو الحال مع MEFs ، ويتم الحصول على أفضل النتائج إذا ما وزعت بالتساوي قطرات حول اللوحة. عودة بعناية لوحة للحاضنة 37 درجة مئوية خلال الليل للسماح للخلايا الأشكال إلى البذور MEFs. تغيير الإعلام ~ بعد 48 ساعة من ذوبان الجليد ، لتحل محل وسائل الاعلام مع الأشكال الجديدة.

Discussion

في هذا الفيديو ، وتبين لنا كيف يحدد المختبر لدينا بشكل روتيني الأشكال الجذعية الجنينية البشرية خلية ثقافة من الأسهم المجمدة. هذه العملية هي قابلة للاستخدام العام مع أي خلايا الثدييات إذا المجمدة في حل DMSO. ذوبان كفاءة أمر ضروري لإرساء ثقافة جديدة من الخلايا الأشكال من الأسهم المجمدة ، والمهم بالنسبة الاتساق التجريبية.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml