Summary
כאן אנו מדגימים כיצד במעבדה שלנו מתחיל גוונים תא גזע עובריים אנושיים תרבות קו ממלאי קפוא.
Abstract
כאן אנו מדגימים כיצד במעבדה שלנו מתחיל גוונים תא גזע עובריים אנושיים תרבות קו ממלאי קפוא. ראשית, 01:59 זקנה ביום העשירי של כ ס"מ צלחת אחת (שני) מוקרן מיליון תאים עובריים בעכבר פיברובלסטים מזין הוא שטף את התקשורת עם גוונים להסיר שאריות ופסולת בסרום התא, ולאחר מכן הוסיף גוונים התקשורת ועזב לאזן בתא תרבות חממה. בקבוקון קפוא של תאים לאחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך או במקפיא-80C היא שמקורו ו שקוע במהירות באמבט מים 37C עבור הפשרה מהירה. תאים בתקשורת הקפאת יוסרו אז מן הבקבוקון והושמו כמויות גדולות של אמצעי התקשורת גוונים. נפח גדול של גוונים התקשורת מאפשר הסרת בסרום עודף DMSO, אשר יכול לגרום גוונים בתאי גזע עובריים אנושיים להבדיל. תאים הם טווה בעדינות מתוך ההשעיה, ולאחר מכן מחדש תלויה בנפח קטן של התקשורת גוונים טרי המשמש מכן זרע את הצלחת MEF. זה נחשב חשוב הזרע צלחת MEF בעדינות על ידי הוספת תאים גוונים בצורה טיפה חכם כדי לפזר אותם באופן שווה לאורך כל הצלחת. הגוונים שהוקם צלחת תרבות מוחזר בחממה במשך 48 שעות לפני התקשורת מוחלף, ואז מוזן כל 24 שעות לאחר מכן.
Protocol
הפשירי ממלאי קפוא:
- לפני ההפשרה התאים גוונים, להבטיח את הצלחת MEF יש לך כבר מוכנה היא מצופה כראוי במצב טוב. אל תנסה להשתמש פחות רצוי צלחת, או אחד כי הוא יותר מבוגר שלושה ימים. מומלץ לסמן מראש את כל צינורות חרוטי ובארות בשימוש.
- טרום גוונים חמים מדיה 37 ° C. גוונים Aliquot התקשורת לתוך צינור חרוטי סטרילי עבור כל שורה. הסר גוונים בקבוקון / s מ -80 ומיד להטביע את החצי התחתון של הצינור בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. זה אמור לקחת בערך 45-60 שניות לפני התאים הם 80% מופשר (חלק קפוא קטן משמאל).
- מהר להביא את הצינור אל מכסה המנוע לזרום למינרית, ספריי עם אלכוהול 70%, בעדינות העברת התאים של טרום חימם התקשורת. ספין הצינור, להסיר התקשורת, resuspend בנפח מתאים של טרי, מחומם מראש מדיה גוונים.
- לשאוב את התקשורת MEF מן כמו בארות רבות ככל שאתה תהיה הפשרה לתוך. מהר, לפני חימם aliquot גוונים התקשורת בחזרה היטב כל הצלחת, נזהר לא להפריע MEFs המצורפת. הגדר את הצלחת הצידה מכסה המנוע. כמו MEFs, התוצאות הטובות ביותר מושגות כאשר טיפות מופצים באופן שווה על הצלחת. בזהירות להחזיר את צלחת 37 ° C חממה לילה כדי לאפשר את הגוונים התאים הזרע MEFs. שינוי מדיה ~ 48 שעות לאחר ההפשרה, להחליף עם התקשורת גוונים טרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בסרטון הזה, אנו מראים כיצד במעבדה שלנו שגרתי קובעת גוונים אנושיים עובריים תרבות נובעות המניות קפוא. תהליך זה הוא נוח לשימוש כללי עם תא יונקים אם קפוא בפתרון DMSO. יעיל הפשרה הוא חיוני לכינון תרבות חדשה של תאים גוונים ממלאי קפוא, ואת חשובה העקביות ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml |
References
- Cowan, C. A. Derivation of Embryonic Stem Cells from Human Blastocysts. , 1650-1656 (2004).
