Le cellule umane ES: Cultura partire da cellule congelate

Summary

Qui mostriamo come il nostro laboratorio ha inizio un essere umano RIFLESSI coltura di linee cellulari staminali embrionali da uno stock congelati.

Abstract

Qui mostriamo come il nostro laboratorio ha inizio un essere umano RIFLESSI coltura di linee cellulari staminali embrionali da uno stock congelati. In primo luogo, un 1-2 giorno di vita piatto dieci cm di circa un (a due) milioni di cellule embrionali di topo irradiati alimentatore fibroblasti è risciacquata con i media RIFLESSI siero per rimuovere residui e detriti cellulari, e poi i media RIFLESSI aggiunto e sinistra per equilibrare in cella cultura incubatore. Un flaconcino di cellule congelato da stoccaggio a lungo termine azoto liquido o un congelatore-80C è di provenienza e rapidamente immersi in un bagno d'acqua 37 ° C per lo scongelamento rapido. Celle di congelamento nei media vengono poi rimossi dal flaconcino e collocato in un grande volume di media tonalità. Il grande volume di sfumature dei media facilita la rimozione di un eccesso di siero e DMSO, che possono causare RIFLESSI cellule staminali embrionali umane per differenziare. Le cellule sono gentilmente è andato fuori di sospensione, e poi risospese in un piccolo volume di fresca mezzi toni che viene poi utilizzato per inizializzare il piatto MEF. E 'considerato importante per seminare la piastra MEF delicatamente aggiungendo le cellule tonalità nel modo goccia a goccia a disperdere in modo uniforme in tutto il loro piatto. La nuova costituzione cultura RIFLESSI piatto viene restituito l'incubatore per 48 ore prima media è sostituito, poi è alimentato ogni 24 ore successive.

Protocol

Disgelo da uno stock congelati:

1. Prima di scongelamento cellule sfumature, in modo che la piastra di MEF è già stato preparato correttamente placcato e in buone condizioni. NON tenta di utilizzare una piastra meno desiderabile, o uno che è più vecchio di tre giorni. Si consiglia di pre-label in uso tutti i tubi conici e pozzi.
   
   
2. Pre-riscaldare i media RIFLESSI a 37 ° C. RIFLESSI aliquota media in una provetta sterile conica per ogni linea. Rimuovere RIFLESSI fiala / s da -80 e subito immergere la metà inferiore del tubo in un bagno di acqua a 37 ° C. Occorrono circa 45-60 secondi prima che le cellule sono 80% scongelati (piccola porzione congelata a sinistra).
   
   
3. Portare rapidamente il tubo alla cappa a flusso laminare, spruzzo giù con alcool al 70%, e delicatamente trasferire le cellule al di pre-riscaldato media. Rotazione del tubo, rimuovere il supporto, e risospendere in un volume adeguato di fresco, pre-riscaldato i media tonalità.
   
   
4. Aspirare fuori i media dal MEF come pozzi quanti sarete in scongelamento. Rapidamente, aliquota pre-riscaldata mezzi RIFLESSI tornare in ciascun pozzetto della piastra, facendo attenzione a non disturbare l'allegata MEF. Sistemare la piastra da parte del cofano. Come con MEF, i migliori risultati si ottengono se le gocce sono distribuite uniformemente sulla piastra. Riportare attentamente la piastra a 37 ° C in incubatore durante la notte per consentire alle cellule RIFLESSI alle sementi il ​​MEF. Modificare i media ~ 48 ore dopo il disgelo, sostituendo con i media fresca tonalità.

Discussion

In questo video si mostra come il nostro laboratorio di routine stabilisce un essere umano RIFLESSI coltura di cellule staminali embrionali da uno stock congelati. Questo processo è suscettibile di uso generale con qualsiasi cellula di mammifero se congelati in una soluzione di DMSO. Scongelamento efficiente è essenziale per stabilire una nuova cultura di cellule RIFLESSI da uno stock congelati, ed è importante per la coerenza sperimentale.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml