Les cellules ES humaines: la culture à partir de cellules congelées

Summary

Ici, nous montrons comment notre laboratoire commence une HUES souches embryonnaires humaines de culture de cellules en ligne à partir d'un stock congelé.

Abstract

Ici, nous montrons comment notre laboratoire commence une HUES souches embryonnaires humaines de culture de cellules en ligne à partir d'un stock congelé. Tout d'abord, un à deux jours âge de dix plaques d'environ un cm (à deux) millions d'embryon de souris irradiées des cellules nourricières de fibroblastes est rincée avec les médias HUES pour enlever le sérum résiduel et les débris cellulaires, puis les médias HUES ajoutée et de gauche à s'équilibrer dans la cellule la culture incubateur. Un flacon congelé des cellules de stockage à long terme de l'azote liquide ou un congélateur-80C est sourcé et rapidement immergé dans un bain d'eau 37C pour la décongélation rapide. Cellules de congélation dans les médias sont alors retirés du flacon et placé dans un grand volume de médias teintes. Le grand volume de teintes des médias facilite l'élimination de l'excès de sérum et de DMSO, ce qui peut causer HUES cellules souches embryonnaires humaines à se différencier. Les cellules sont délicatement filé hors de la suspension, puis remis en suspension dans un faible volume de média HUES douce qui est ensuite utilisée pour ensemencer la plaque du MEF. Il est considéré comme important de semences de la plaque par le MEF ajoutant doucement les cellules teintes dans une mode goutte à goutte à travers les disperser uniformément la plaque. La plaque de culture nouvellement établie HUES est retourné à l'incubateur pendant 48 heures avant que le média est remplacé, est ensuite introduit toutes les 24 heures qui suivent.

Protocol

Dégel à partir d'un stock congelé:

1. Avant de décongélation des cellules teintes, s'assurer que la plaque MEF vous avez déjà préparé est bien plaqué et en bon état. NE PAS essayer d'utiliser une plaque de moins souhaitables, ou un qui est plus de trois jours. Il est recommandé de pré-étiqueter tous les tubes coniques et des puits utilisés.
   
   
2. Préchauffer les médias HUES à 37 ° C. HUES Aliquoter des médias dans un tube stérile conique pour chaque ligne. Retirer HUES flacon / s de -80 et immédiatement plonger la moitié inférieure du tube dans un bain à 37 ° C l'eau. Il devrait prendre environ 45-60 secondes avant que les cellules sont décongelées 80% (petite partie gelée à gauche).
   
   
3. Vite, apportez le tube à la hotte à flux laminaire, par pulvérisation avec de l'alcool à 70%, et doucement le transfert des cellules à la pré-chauffé médias. Spin le tube, retirer le support, et remettre en suspension dans un volume approprié de frais, les médias HUES préchauffé.
   
   
4. Aspirer les médias du MEF que de nombreux puits que vous serez dans le dégel. Rapidement, aliquot préchauffé médias HUES retour dans chaque puits de la plaque, en faisant attention à ne pas perturber l'attachée FAE. Placer la plaque de côté dans le capot. Comme avec FAE, les meilleurs résultats sont obtenus si les gouttes sont réparties uniformément sur la plaque. Soigneusement ramener la plaque à un incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour permettre aux cellules HUES aux semences de la FAE. Changer les médias ~ 48 heures après le dégel, la remplaçant par des médias HUES frais.

Discussion

Dans cette vidéo, nous montrons comment notre laboratoire établit régulièrement une HUES culture humaine de cellules souches embryonnaires à partir d'un stock congelé. Ce processus est prête pour une utilisation générale avec toute cellule de mammifère s'ils sont congelés dans une solution de DMSO. Efficace dégel est essentiel pour établir une nouvelle culture de cellules HUES partir d'un stock congelé, et elle est importante pour la cohérence expérimental.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 mL Glutamin 6.5 ml NEAA 6.5 mlbeta-mercapt–thanol 0.5 µl KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 mL bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml