Summary
Deze video is een technische demonstratie van de hybridisatie protocol voor hele genoom betegelen pad array CGH, die het hele menselijke genoom met slechts 25 tot 100 ng van DNA kan worden geïsoleerd uit een verscheidenheid aan bronnen, waaronder archiefmateriaal formaline gefixeerd materiaal scans.
Abstract
Array comparative genomic hybridisatie (array CGH) is een methode voor het detecteren van winsten en verliezen van DNA-segmenten of gen dosering in het genoom 1. Recente ontwikkelingen in deze technologie in staat hebben gesteld een hoge resolutie vergelijking van hele genomen voor de identificatie van genetische veranderingen in kanker en andere genetische ziekten 2. De Sub-Megabase Resolution Tegelwerk-set array (of SMRT) array bestaat uit een set van ongeveer dertigduizend overlappende bacteriële kunstmatig chromosoom (BAC) klonen die het menselijk genoom in ~ 100 kilobase pair (kb) segmenten 2 span. Deze BAC targets zijn individueel gesynthetiseerd en gespot in tweevoud op een glasplaatje 2-4. Array CGH is gebaseerd op het principe van concurrerende hybridisatie. Monster en referentie-DNA zijn verschillend gelabeld met Cyanine-3 en Cyanine-5 fluorescerende kleurstoffen, en co-gehybridiseerd aan de array. Na een incubatietijd van de niet-gebonden monsters worden gewassen van de glijbaan en de array is afgebeeld. Een vrij beschikbare aangepaste software pakket genaamd SeeGH (www.flintbox.ca) wordt gebruikt om de grote hoeveelheid gegevens die zijn verzameld proces - een enkel experiment genereert 53.892 data punten. SeeGH visualiseert de log2 signaal intensiteit verhouding tussen de twee monsters bij elke BAC doelgroep die verticaal is uitgelijnd met chromosomale positie van 5,6. De SMRT array kan detecteren veranderingen zo klein zijn als 50 kb in maat 7. De SMRT array kan detecteren een verscheidenheid van DNA herschikking evenementen, waaronder DNA-winsten, verliezen, amplificaties en homozygote deleties. Een uniek voordeel van de SMRT array is dat men kan gebruiken DNA geïsoleerd uit formaline gefixeerd paraffine ingebed monsters. In combinatie met de lage input eisen van onversterkte DNA (25-100ng) dit maakt profilering van kostbare monsters, zoals die geproduceerd door microdissectie 7,8. Dit wordt toegeschreven aan de grote omvang van elke BAC hybridisatie doelgroep die het mogelijk maakt de binding van voldoende gelabelde monsters te produceren signalen voor detectie. Een ander voordeel van dit platform is de tolerantie van weefsel heterogeniteit, het verminderen van de noodzaak voor vervelende weefsel microdissectie 8. Deze video protocol is een stap-voor-stap handleiding van etikettering de input-DNA door middel van de verwerving signaal voor het hele genoom tegels pad SMRT array.
Protocol
PROBE ETIKETTERING
Let op: limiet blootstelling van Cye Kleurstoffen aan het licht te allen tijde (dit kan worden bereikt door te werken in een donkere ruimte of door het afschermen van de buizen met een dekking, zoals aluminiumfolie)
- Te combineren:
(Setup 1 reactie tube als referentie en voor een reactie buis voor monster)- DNA (25-400 ng)
- 5 pi van 5x willekeurige primers buffer (Eindconcentratie: 5x Promega Klenow buffer en 7 microgram / pi willekeurig octamers)
- Verdun tot 17,0 uL het totale volume met gedestilleerd H 2 O
- Kook gedurende 10 minuten op 100 ° C. Overdracht onmiddellijk op ijs gedurende 1 minuut.
- Voeg 4 ul van 10X dNTP mix (2mm dATP, dGTP, dTTP, 1.2mm dCTP).
- Voeg CyeDyes:
- Voeg 2 pl (2 nmol) van Cy-3 gelabeld dCTP om DNA-monster
- Voeg 2 pl (2 nmol) van Cy-5 gelabeld dCTP Verwijzing DNA (bijv. Novagen menselijk genoom DNA)
- Voeg 2,5 ul van Klenow (9 U / pi, Promega) en meng.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht * (~ 18 uur).
* De overnachting hybridisatie tijd kan worden ingesteld tussen de 14 en 24 uur zonder schadelijke gevolgen voor de etikettering proces aan te passen naar een laboratorium schema.
SAMPLE OPRUIMEN
(Gecombineerde sensor clean-up en voorbereiding voor hybridisatie)
- Met behulp van een Microcon YM-30 kolom:
- Voeg 100 ul Cot-1 DNA (1μg/μL) naar kolom. Raak membraan met pipetpunt.
- Zwembad de reacties (referentie en monster) en toe te voegen aan kolom.
- Plaats column in de daarvoor bestemde buis en draaien op 13.000 g gedurende 10 minuten.
- Voeg 200 uL gedistilleerd H 2 0 tot en membraan en herhaal draaien te wassen.
- Gooi buis en voeg 45 pi hybridisatie-oplossing: (Roche DIG Easy)
- Omkeren Microcon, plaats in een nieuw label buis, en draaien op 3000 g gedurende 3 minuten.
BEREKENING VAN oprichtingen
- Verwijder de 1,5 pi en te meten met behulp van fluorofoor incorporatie NanoDrop spectrofotometer. Het gebruik van uw hybridisatiebuffer als een blanco (DIG Easy) volg de aanwijzingen op het scherm. (Je kunt herstellen het monster van het voetstuk, indien nodig, na de meting.)
(Let op:. Oprichtingen beneden 3,0 pmol / ul in een van beide kanalen hebben verschillende resultaten laten) - Denatureren bij 85 ° C gedurende 10 minuten.
- Plaats dan de probe bij 45 ° C gedurende 30 minuten tot 1 uur (kan Cot-1 DNA gloeien.)
ARRAY hybridisatie
- Plaats 44 pi probe-oplossing op het dekglaasje (22 mm x 60 mm) (Fisher Scientific). Indien beschikbaar, de dekglaasje op een dia warmer of warmte te blokkeren voorverwarmd tot 45 ° C om temperatuur te handhaven.
- Lijn schuiven over dekglaasje en probe-oplossing, lagere rand van de glijbaan waardoor contact met de hybridisatie-oplossing. Verder te verlagen tot het dekglaasje is bevestigd aan de dia met oppervlaktespanning. Omgekeerde glijbaan.
- Plaats de dia in hybridisatie cassette (Telechem), pre-verwarmd tot 45 ° C, en voeg 10 ul van het water in de onderste groef (om vochtigheid controle tijdens hybridisatie).
- Seal cassette en incubeer voor 36 - 40 uur bij 45 ° C.
ARRAY WASSEN
Opmerking: Alle wassen oplossingen zijn bij pH 7,0
Verwijdering van de dia in de hybridisatie cassette is van cruciaal belang. DIG Gemakkelijk kristalliseert snel bij kamertemperatuur. De dia dient onmiddellijk te worden ondergedompeld en de dekking slip verwijderd in de wasoplossing.
- Voeg ongeveer 60 ml van 0.1XSSC, 0,1% SDS (pH 7,0, 45 ° C) voordat wassen oplossing voor een Coplin pot aan het openen van de hybridisatie kamer.
- Open kamer, voeg glijden oplossing te wassen en dekglaasje (het moet glijden) te verwijderen.
- Was de slide 3 keer in 0.1XSSC + 0,1% SDS bij 45 ° C gedurende 1 minuut elk met agitatie.
- Spoel de slide 3 keer in verse 0.1XSSC *. Er mogen geen residu belletjes uit de SDS was zichtbaar.
* De dia's kan blijven in de uiteindelijke oplossing was pas klaar om centrifuge en (~ 15 minuten) te scannen. - Centrifugeer de dia in een 50 ml Falcon buizen bij 700 g gedurende 3 minuten.
- Onmiddellijk scan de dia's (signaal intensiteit zal afnemen in de tijd.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Slechte kwaliteit DNA zal niet in een goede hybridisatie profiel. Het is essentieel om ervoor te zorgen dat de monster en DNA-vrij zijn van verontreinigingen zoals fenol, RNA, zout, enz. dat kan met de random eerste etikettering stap bemoeien voordat een hybridisatie experiment. Bijvoorbeeld de resuspensie van DNA in Tris - EDTA (TE) in plaats van water is niet aan te raden zo hoog zoutgehalte kan remmen de etikettering reactie. We raden aan het testen van DNA-kwaliteit met behulp van de Nanodrop spectrofotometer om zowel de hoeveelheid DNA en de algehele vorm van de absorptie curve en de 260/280, 260/230 verhouding te meten.
Wassen: Het verwijderen van de dia in de hybridisatie cassette en de overdracht van het verwarmde wasoplossing is een cruciale stap in het proces van hybridisatie als de DIG Eenvoudige hybridisatie-oplossing kristalliseert zeer snel. Het is belangrijk dat de was-oplossingen bij een neutrale pH en de temperatuur van de wasoplossing is belangrijk voor de strengheid tijdens het verwijderen van de ongebonden probe. Na het drogen dia's is het belangrijk om ze te bewaren in het donker, zo niet het scannen meteen, of na het scannen als u wenst om deze opnieuw te scannen op een later tijdstip.
Ozon: Ozon is een wereldwijde zorg bij het uitvoeren van array CGH. Ozonconcentraties boven de 5 ppm is aangetoond dat negatieve invloed op de Cye kleurstoffen. CYE 5 is bijzonder gevoelig voor ozon degradatie. Het minimaliseren van blootstelling aan ozon is de sleutel tot het voorkomen van Cye kleurstof degradatie en het verlies van het signaal voor en tijdens het scannen. Scannen 's nachts bijvoorbeeld, wanneer het milieu ozon is meestal lager is, is een mogelijke optie. Ozon vrij behuizingen voor automatische slide wassen en scan-en diverse chemische schuif behandelingen zijn commercieel verkrijgbaar. Ozonbestendig Cye kleurstoffen zijn ook recent ontwikkeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij willen de leden van de Wan Lam Lab BAC Array team vooral Miwa Suzuki en Bryan Chi bedanken voor de voorbereiding van dit artikel. Dit werk werd ondersteund met middelen uit de Canadese Institutes for Health Research, Genome Canada / Genome British Columbia, en NIH / NIDCR verlenen RO1 DE15965-01.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
