Summary
Dieses Video ist eine technische Demonstration der Hybridisierung Protokoll für gesamte Genom Fliesen Weg Array-CGH, die das gesamte menschliche Genom mit nur 25-100 ng DNA, die aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Archivierung Formalin fixiert Material isoliert werden können Scans.
Abstract
Array komparative genomische Hybridisierung (Array-CGH) ist eine Methode zum Nachweis von Gewinnen und Verlusten von DNA-Segmenten oder Gen-Dosierung in das Genom 1. Jüngste Fortschritte in dieser Technologie sind mit hochauflösenden Vergleich ganzer Genome für die Identifizierung genetischer Veränderungen bei Krebs und anderen genetischen Erkrankungen 2 aktiviert. Die Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (oder SMRT)-Array besteht aus einer Reihe von rund 30.000 überlappenden bakterielle künstliche Chromosom (BAC) Klone, die das menschliche Genom in ~ 100 Kilobasenpaar (kb) Segmente 2 span zusammen. Diese BAC-Ziele werden individuell hergestellt und entdeckte in zweifacher Ausfertigung auf einem einzigen Objektträger 2-4. Array-CGH ist auf dem Prinzip der kompetitiven Hybridisierung. Proben-und Referenz-DNA werden differentiell mit Cyanin-3 bezeichnet und Cyanine-5 Fluoreszenzfarbstoffe, und das Array co-hybridisiert. Nach einer Inkubationszeit die ungebundenen Proben werden von der Folie gewaschen und das Array abgebildet. Eine frei verfügbare kundenspezifische Software-Paket namens SeeGH (www.flintbox.ca) wird verwendet, um die große Menge an Daten gesammelt Prozess - einem einzigen Experiment erzeugt 53.892 Datenpunkte. SeeGH visualisiert die log2 Signalintensität Verhältnis zwischen den 2 Proben an jedem BAC Ziel, die vertikal mit chromosomalen Position 5,6 ausgerichtet ist. Der SMRT Array erkennt Änderungen so klein wie 50 kb in Größe 7. Der SMRT Array erkennt eine Vielzahl von DNA Umlagerung Veranstaltungen, darunter DNA Gewinne, Verluste, Amplifikationen und homozygote Deletionen. Ein einzigartiger Vorteil der SMRT Array ist, dass man DNA aus Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten Proben isoliert zu verwenden. In Verbindung mit dem niedrigen Eingang Anforderungen der unverstärkten DNA (25-100 ng) kombiniert dies ermöglicht Profilierung der wertvollen Proben, wie sie durch Mikrodissektion 7,8 produziert. Dies ist auf die Größe der einzelnen BAC-Hybridisierung Ziel, dass die Bindung von ausreichend markierten Proben, um Signale für den Nachweis produzieren können zugeschrieben. Ein weiterer Vorteil dieser Plattform ist die Toleranz des Gewebes Heterogenität, der Bedarf an langwierige Gewebe Mikrodissektion 8. Dieses Video-Protokoll ist ein Schritt-für-Schritt-Anleitung von der Kennzeichnung der eingesetzten DNA bis hin zur Übernahme des gesamten Genoms Fliesen Weg SMRT Array Signal.
Protocol
Sondenmarkierung
Hinweis: Begrenzung der Exposition Cye Farbstoffe, um Licht zu jeder Zeit (dies kann durch die Arbeit in einem abgedunkelten Raum oder durch Abschirmung der Rohre mit einer Abdeckung wie Aluminiumfolie erreicht werden)
- Kombinieren Sie:
(Setup 1 Reaktionsgefäß als Referenz und 1 Reaktionsrohr Probe)- DNA (25-400 ng)
- 5 ul 5X random Primer (Endkonzentration: 5X Promega Klenow-Puffer und 7 ug / ul random Octamere)
- Verdünnen auf 17,0 ul Gesamtvolumen mit destilliertem H 2 O
- Kochen für 10 Minuten bei 100 ° C. Sofort auf Eis für 1 Minute.
- Add 4 ul 10x dNTP-Mix (2 mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP 1,2 mm).
- Add CyeDyes:
- Add 2 ul (2 nmol) von Cy-3 markiertem dCTP zu Proben-DNA
- Add 2 ul (2 nmol) von Cy-5 markierten dCTP zu Referenz-DNA (zB Novagen humanen genomischen DNA)
- Add 2,5 ul Klenow (9 U / ul, Promega) und mischen.
- Bei 37 ° C über Nacht * (~ 18 Stunden).
* Die Hybridisierung über Nacht kann zwischen 14 bis 24 Stunden ohne Beeinträchtigung der Labelling-Verfahren in ein Labor Zeitplan passen eingestellt werden.
Probenaufbereitung
(Combined Sonde clean-up und Vorbereitung für die Hybridisierung)
- Mit einem Microcon YM-30 Spalte:
- 100 l Cot-1 DNA (1μg/μL) in die Spalte. Berühren Sie nicht Membran mit Pipettenspitze.
- Pool der Reaktionen (Referenz und Probe) und fügen Sie in die Spalte.
- Legen Spalte in sofern Rohr und Spin bei 13000 g für 10 Minuten.
- Geben Sie 200 ul destilliertem H 2 0 auf die Membran und wiederholen Spin zu waschen.
- Discard Tube und füge 45 ul Hybridisierungslösung: (Roche DIG Easy)
- Invert Microcon, Platz in einer neuen Bezeichnung Rohr und drehen sich mit 3000 g für 3 Minuten.
BERECHNUNG Eingemeindungen
- Entfernen 1,5 ul und messen Fluorophor Einbau mit NanoDrop Spektralphotometer. Mit Ihrem Hybridisierungspuffer wie eine leere (DIG Easy) folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm. (Sie können die Probe aus dem Sockel zu erholen, falls erforderlich, nach der Messung.)
(Hinweis:. Incorporations unter 3,0 pmol / ul in einem der Kanäle zeigten unterschiedliche Ergebnisse) - Denaturieren bei 85 ° C für 10 Minuten.
- Legen Sonde bei 45 ° C für 30 Minuten bis 1 Stunde (erlaubt Cot-1 DNA Glühen.)
ARRAY HYBRIDIZATION
- Platz 44 ul Probe-Lösung auf das Deckglas (22 mm x 60 mm) (Fisher Scientific). Falls vorhanden, legen Sie das Deckglas auf einem Objektträger wärmer oder Heizblock auf 45 vorgewärmten ° C auf Temperatur zu halten.
- Richten Sie gleiten über Deckglas und Probe-Lösung, untere Kante der Folie ermöglicht den Kontakt mit der Hybridisierungslösung. Weiter zu senken, bis das Deckglas auf dem Objektträger mit der Oberflächenspannung verbunden ist. Invert gleiten.
- Legen Sie die Folie in Hybridisierung Kassette (Telechem), vorgewärmt auf 45 ° C, und fügen Sie 10 l Wasser in die untere Nut (gegen Feuchtigkeit während der Hybridisierung Steuerung).
- Seal Kassette und inkubieren 36 bis 40 Stunden bei 45 ° C.
ARRAY WASCHEN
Hinweis: Alle Waschlösungen werden bei pH 7,0
Das Entfernen der Folie aus der Hybridisierung Kassette ist kritisch. DIG Easy schnell kristallisiert bei Raumtemperatur. Der Schlitten sollte sofort eingetaucht werden und das Deckglas in der Waschlösung entfernt.
- Fügen Sie ca. 60 ml 0.1XSSC, 0,1% SDS (pH 7,0, 45 ° C) waschen Lösung für ein Coplin Glas vor dem Öffnen der Hybridisierung Kammer.
- Offene Kammer, fügen Folie Lösung zu waschen und zu entfernen Deckglas (es sollte abrutschen).
- Waschen Sie die Folie 3 mal in 0.1XSSC + 0,1% SDS bei 45 ° C für 1 Minute unter Rühren.
- Spülen Sie die Folie 3 mal in frischem 0.1XSSC *. Es sollte kein Rest-Blasen aus dem SDS waschen sichtbar werden.
* Die Folien können in der letzten Waschlösung bis zu seiner Zentrifuge und Scannen (~ 15 Minuten) bleiben. - Zentrifugieren Sie die Folie in einer 50 ml Falcon-Röhrchen bei 700 g für 3 Minuten.
- Unmittelbar scannen die Dias (Signalintensitäten im Laufe der Zeit abnehmen.)
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Discussion
Schlechte Qualität DNA wird nicht eine gute Hybridisierung Profil. Es ist wichtig, dass die Probe zu gewährleisten und Referenz-DNA sind frei von Verunreinigungen wie Phenol, RNA, Salz, etc, die mit dem random prime Kennzeichnung Schritt vor Beginn einer Hybridisierung Experiment stören können. Zum Beispiel die Resuspension der DNA in Tris - EDTA (TE) anstelle von Wasser ist nicht so hohe Salzkonzentration empfohlen hemmen können die Kennzeichnung Reaktion. Wir empfehlen Testen DNA-Qualität mit dem Nanodrop Spektralphotometer, um sowohl die DNA-Menge sowie allgemeine Form der Absorptionskurve und 260/280, 260/230 Verhältnis zu messen.
Waschen: Das Entfernen der Folie aus der Hybridisierung Kassette und die Übertragung auf die beheizte Waschlösung ist ein kritischer Schritt bei der Hybridisierung Prozess wie der DIG Easy Hybridisierungslösung kristallisiert sehr schnell. Es ist wichtig, dass die Waschlösungen bei einem neutralen pH und die Temperatur der Waschlösung für Stringenz wichtig beim Entfernen der ungebundenen Sonde. Nach dem Trocknen gleitet, ist es wichtig, sie im Dunkeln zu halten, wenn nicht das Scannen sofort, oder nach dem Scannen, wenn Sie sie zu einem späteren Zeitpunkt erneut prüfen wollen.
Ozon: verfügt über ein weltweites Anliegen bei der Durchführung von Array-CGH. Ozonwerte über 5 ppm haben gezeigt, dass sich negativ auf die Cye Farbstoffe. Cye 5 ist besonders empfindlich auf Ozon-Abbau. Minimierung der Ozonbelastung ist der Schlüssel zur Verhinderung Cye Farbstoff Abbau und Verlust des Signals vor und während des Scanvorgangs. Scanning in der Nacht zum Beispiel, wenn die Umwelt Ozon in der Regel niedriger ist, ist eine mögliche Option. Ozonfreie Gehäuse für automatisierte Dia Waschen und Scannen und verschiedene chemische Dia-Behandlungen sind im Handel erhältlich. Ozonbeständig Cye Farbstoffe haben auch vor kurzem entwickelt worden.
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Acknowledgments
Wir wünschen den Mitgliedern des Wan Lam Lab BAC-Array-Team vor allem Miwa Suzuki und Bryan Chi für die Vorbereitung dieses Artikels danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus Canadian Institutes for Health Research, Genome Canada / Genome British Columbia, und NIH / NIDCR gewähren RO1 DE15965-01 unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
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