Summary
इस वीडियो के पूरे जीनोम खपरैल का छत पथ सरणी CGH, जो पूरे मानव जीनोम डीएनए कि अभिलेखीय formalin तय सामग्री सहित सूत्रों की एक किस्म से अलग किया जा सकता का केवल 25-100 एनजी का उपयोग कर स्कैन के लिए एक संकरण प्रोटोकॉल के तकनीकी प्रदर्शन है.
Abstract
सरणी तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (सरणी CGH) डीएनए खंडों या 1 जीनोम में जीन खुराक के लाभ और नुकसान का पता लगाने के लिए एक विधि है. इस प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों के कैंसर और अन्य आनुवंशिक रोगों 2 में आनुवंशिक परिवर्तन की पहचान के लिए पूरे जीनोम के उच्च संकल्प की तुलना में सक्षम है. संकल्प उप Megabase खपरैल का छत सेट सरणी (या SMRT) सरणी लगभग तीस हजार जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) क्लोन है कि ~ 100 kilobase जोड़ी में मानव जीनोम (केबी) खंडों 2 अवधि अतिव्यापी का एक सेट शामिल है . ये बीएसी लक्ष्य व्यक्तिगत और संश्लेषित कर रहे हैं एक गिलास स्लाइड 2-4 पर दो प्रतियों में देखा. ऐरे CGH प्रतिस्पर्धी संकरण के सिद्धांत पर आधारित है. संदर्भ और डीएनए नमूना विभिन्न Cyanine-3 के साथ लेबल रहे हैं और Cyanine-5 फ्लोरोसेंट रंजक, और सरणी के लिए सह - संकरित. एक ऊष्मायन अवधि के बाद अनबाउंड नमूने स्लाइड से धो रहे हैं और सरणी imaged है. एक आज़ादी से उपलब्ध कस्टम सॉफ्टवेयर SeeGH (www.flintbox.ca) नामक पैकेज एकत्र डेटा की बड़ी मात्रा प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है - एक ही प्रयोग में 53,892 डेटा बिंदु उत्पन्न. प्रत्येक बीएसी लक्ष्य पर 2 नमूने जो खड़ी गुणसूत्र 5,6 स्थिति के साथ गठबंधन किया है के बीच SeeGH log2 संकेत तीव्रता अनुपात visualizes . SMRT सरणी के रूप में 7 आकार में 50 केबी के रूप में छोटे परिवर्तन का पता लगा सकते हैं. SMRT सरणी डीएनए डीएनए लाभ, हानि, amplifications और homozygous विलोपन सहित पुनर्व्यवस्था घटनाओं की एक किस्म का पता लगा सकते हैं. SMRT सरणी का एक अनूठा लाभ यह है कि एक formalin तय आयल एम्बेडेड नमूनों से पृथक डीएनए का उपयोग कर सकते हैं. जब unamplified डीएनए (25-100ng) के कम इनपुट आवश्यकताओं के साथ संयुक्त इस 7,8 microdissection द्वारा उत्पादित उन के रूप में कीमती नमूनों की रूपरेखा की अनुमति देता है . यह प्रत्येक बीएसी संकरण लक्ष्य है कि पता लगाने के लिए संकेतों का उत्पादन के लिए पर्याप्त लेबल नमूने के बंधन की अनुमति देता है बड़े आकार के लिए जिम्मेदार ठहराया है. इस मंच का एक अन्य लाभ ऊतक विविधता की सहिष्णुता है, थकाऊ ऊतक 8 microdissection के लिए की जरूरत कम है. यह वीडियो प्रोटोकॉल के माध्यम से इनपुट डीएनए लेबलिंग पूरे जीनोम खपरैल का छत पथ SMRT सरणी के लिए अधिग्रहण संकेत से एक कदम दर कदम ट्यूटोरियल है.
Protocol
जांच लेबलिंग
नोट: सीमा Cye रंगों के सभी समय पर प्रकाश में जोखिम (यह एक अंधेरे क्षेत्र में काम करके या एल्यूमीनियम पन्नी के रूप में एक कवर के साथ ट्यूबों परिरक्षण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है )
- हारवेस्टर:
(संदर्भ के लिए और नमूने के लिए 1 प्रतिक्रिया ट्यूब 1 प्रतिक्रिया ट्यूब सेटअप)- डीएनए (25-400 एनजी)
- 5X यादृच्छिक प्राइमरों बफर के 5 μL (अंतिम एकाग्रता: 5X Promega Klenow बफर और 7 μg / μL यादृच्छिक octamers)
- आसुत एच 2 हे के साथ 17.0 μL कुल मात्रा के लिए पतला
- 100 पर 10 मिनट के लिए उबाल लें डिग्री सेल्सियस 1 मिनट के लिए बर्फ के लिए तुरंत स्थानांतरण.
- 10X dNTP मिश्रण (2mm dATP, dGTP, dTTP, 1.2mm dCTP) के 4 μL जोड़ें.
- CyeDyes जोड़ें:
- नमूना डीएनए Cy-3 लेबल dCTP (2 nmoles) के 2 μL जोड़ें
- संदर्भ डीएनए (जैसे, Novagen मानव जीनोमिक डीएनए) Cy-5 लेबल dCTP 2 μL (2 nmoles) जोड़ें
- Klenow के 2.5 μL (9 यू / μL, Promega) और मिश्रण जोड़ें.
- 37 में सेते डिग्री सेल्सियस रातोंरात * (~ 18 घंटे).
* रातोंरात संकरण समय प्रतिकूल लेबलिंग प्रक्रिया को प्रभावित करने के लिए एक प्रयोगशाला कार्यक्रम के लिए फिट के बिना 14 से 24 घंटे के बीच में समायोजित किया जा सकता है.
नमूना क्लीन अप
(संयुक्त जांच साफ - अप और संकरण के लिए तैयार)
- Microcon YM 30 कॉलम का प्रयोग:
- 100 μL खटिया 1 (1μg/μL) डीएनए स्तंभ जोड़ें. विंदुक टिप के साथ झिल्ली मत छुओ.
- पूल प्रतिक्रियाओं (संदर्भ और नमूना) और स्तंभ को जोड़ने.
- प्रदान की है और 10 मिनट के लिए 13000 जी पर ट्यूब स्पिन में रखें स्तंभ.
- झिल्ली को 200 μL आसुत 2 एच 0 जोड़ें और स्पिन दोहराने के लिए धो.
- ट्यूब त्यागें और 45 μL संकरण समाधान जोड़ने के लिए: (Roche डीआईजी आसान)
- उलटें Microcon, एक नया लेबल ट्यूब में जगह है, और 3 मिनट के लिए 3000 ग्राम पर स्पिन.
Incorporations की गणना
- 1.5 μL और उपाय fluorophore NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग समावेश निकालें. एक रिक्त (डीआईजी आसान) के रूप में अपने संकरण बफर का प्रयोग स्क्रीन पर निर्देशों का पालन करें. (आप कुरसी से नमूना ठीक हो, यदि आवश्यक हो सकता, माप के बाद.)
(ध्यान दें: 3.0 pmol / या तो चैनल में μL नीचे incorporations चर परिणाम से पता चला है ) - 85 में denature ° सी 10 मिनट के लिए.
- प्लेस जांच में 45 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट 1 घंटा (annealing खटिया-1 डीएनए की अनुमति देता है.) के लिए
ARRAY संकरण
- Coverslip पर प्लेस 44 μL जांच समाधान (22 मिमी x 60 मिमी) (फिशर साइंटिफिक). यदि उपलब्ध हो, किसी स्लाइड पर coverslip जगह गर्म या गर्मी ब्लॉक 45 से पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस तापमान बनाए रखने के लिए.
- Coverslip और जांच के समाधान पर स्लाइड, कम स्लाइड के एक किनारे संकरण समाधान के साथ संपर्क की अनुमति संरेखित करें. कम के लिए जारी रखें जब तक coverslip सतह के तनाव के साथ स्लाइड में संलग्न है. स्लाइड उलटें.
- संकरण कैसेट (Telechem) में स्लाइड प्लेस, 45 पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस, और कम नाली (संकरण के दौरान आर्द्रता नियंत्रण) में पानी की 10 μL जोड़ने.
- 36 के लिए सील कैसेट और सेते - 45 में 40 घंटे डिग्री सेल्सियस
ARRAY वाशिंग
नोट: सभी धोने के समाधान 7.0 पीएच पर हैं
स्लाइड के संकरण कैसेट से हटाना महत्वपूर्ण है. डीआईजी आसान जल्दी से कमरे के तापमान पर क्रिस्टलीकृत. स्लाइड तुरंत हो और डूब चाहिए कवर पर्ची धोने समाधान में हटा दिया.
- 0.1XSSC के लगभग 60 एमएल, एसडीएस 0.1% (7.0 पीएच, 45 डिग्री सेल्सियस) एक Coplin जार करने के लिए हल संकरण कक्ष खोलने से पहले धो लो. जोड़ें
- ओपन कक्ष, स्लाइड जोड़ने के लिए समाधान धोने और coverslip (इसे बंद स्लाइड चाहिए) हटायें.
- स्लाइड डिग्री सेल्सियस 1 मिनट प्रत्येक के लिए आंदोलन के साथ धो 0.1XSSC में 3 बार + एसडीएस 45 में 0.1%.
- स्लाइड ताजा 0.1XSSC में 3 बार कुल्ला *. एसडीएस दिखाई धोने से कोई अवशिष्ट बुलबुले होना चाहिए.
* स्लाइड अंतिम धोने के समाधान में अपकेंद्रित्र लिए तैयार है और स्कैन (~ 15 मिनट) तक रह सकते हैं. - 3 मिनट के लिए 700 ग्राम में एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूबों में स्लाइड अपकेंद्रित्र.
- स्लाइड्स तुरंत स्कैन (संकेत तीव्रता समय के साथ कम हो जाएगा.)
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Discussion
गरीब गुणवत्ता डीएनए एक अच्छा संकरण प्रोफ़ाइल उपलब्ध नहीं कराएगा. यह आवश्यक है कि नमूना सुनिश्चित करने और संदर्भ डीएनए phenol, शाही सेना, नमक, आदि है कि यादृच्छिक प्रधानमंत्री लेबलिंग कदम के साथ संकरण प्रयोग शुरू करने से पहले हस्तक्षेप कर सकते हैं जैसे contaminants से मुक्त कर रहे हैं. उदाहरण के लिए Tris में डीएनए के resuspension EDTA (ते) के पानी के बजाय उच्च नमक एकाग्रता के रूप में अनुशंसित नहीं है लेबलिंग प्रतिक्रिया को बाधित कर सकते हैं. हम डीएनए Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने के लिए दोनों डीएनए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से absorbance वक्र के समग्र आकार और 260/280, 260/230 अनुपात मात्रा को मापने गुणवत्ता परख करने की क्रिया की सलाह देते हैं.
धुलाई: संकरण कैसेट से स्लाइड को हटाने और गर्म धोने के समाधान के लिए स्थानांतरित संकरण की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है डीआईजी आसान संकरण समाधान के रूप में बहुत जल्दी क्रिस्टलीकृत. यह महत्वपूर्ण है कि धोने समाधान एक तटस्थ पीएच पर और धोने के समाधान के तापमान तंगी के लिए महत्वपूर्ण है जबकि अनबाउंड जांच हटाने. स्लाइड्स सुखाने के बाद यह महत्वपूर्ण स्कैनिंग सही दूर नहीं, या यदि स्कैनिंग अगर आप उन्हें एक बाद में समय पर रिस्कैन की इच्छा के बाद उन्हें अंधेरे में रखने के लिए है.
ओजोन: ओजोन एक दुनिया भर में चिंता का विषय किया गया है जब सरणी CGH प्रदर्शन. 5ppm ऊपर ओजोन स्तर प्रतिकूल Cye रंगों को प्रभावित दिखाया गया है. 5 Cye विशेष रूप से ओजोन क्षरण के प्रति संवेदनशील है. ओजोन जोखिम कम से कम Cye डाई गिरावट और संकेत के पहले और दौरान स्कैनिंग नुकसान को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए रात में स्कैन, जब पर्यावरण ओजोन आम तौर पर कम है, एक संभव विकल्प है. स्वचालित वाशिंग और स्कैनिंग स्लाइड और विभिन्न रासायनिक स्लाइड उपचार के लिए ओजोन मुक्त बाड़ों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. ओजोन प्रतिरोधी Cye रंजक भी हाल ही में विकसित किया गया है.
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Acknowledgments
हम इस लेख की तैयारी के लिए वान Lam लैब बीएसी ऐरे विशेष रूप से Miwa सुजुकी और ब्रायन ची टीम के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं. इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान, जीनोम कनाडा / जीनोम ब्रिटिश कोलंबिया, और NIH / NIDCR अनुदान DE15965 01-RO1 के लिए कनाडा के संस्थानों से धन के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
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