Summary
이 비디오 아카이브 포르말린 고정 재료를 포함한 다양한 소스에서 격리 수있는 DNA의 단지 25-100 NG를 사용하여 전체 인간 게놈을 검사 전체 게놈 기와 경로 배열 CGH에 대한 하이브 리다이 제이션 프로토콜의 기술 데모입니다.
Abstract
배열 비교 게놈 하이브 리다이 제이션의 (배열 CGH)은 DNA의 세그먼트 또는 게놈 1 유전자 복용량의 이득과 손실을 검출하는 방법입니다. 이 기술의 최근 발전은 암 및 기타 유전 질환 2 유전자 변경의 식별을 위해 전체 genomes의 고해상도 비교를 활성화했습니다. 서브 Megabase 해상도 기와 집합 배열 (또는 SMRT) 배열은 약 삼만은 세균 인공 염색체 (BAC) ~ 100 kilobase 쌍에서 인간 게놈 (KB) 세그먼트 2 스팬 클론을 중복 집합으로 구성되어 있습니다. 이러한 BAC 대상 개별적으로 합성하여 하나의 유리 슬라이드에 중복 2-4에서 발견됩니다. 배열 CGH 경쟁 하이브 리다이 제이션의 원칙에 따라 달라집니다. 샘플 및 참조 DNA가 differentially Cyanine - 3으로 표시하고 Cyanine - 5 형광 염료 및 배열에 공동 hybridized입니다. 잠복기 후 언바운드 샘플은 슬라이드에서 씻은되며 배열이 몇 군데 있습니다. SeeGH (www.flintbox.ca)라는 무료로 사용 가능한 맞춤 소프트웨어 패키지는 수집된 데이터의 양이를 처리하는 데 사용됩니다 - 하나의 실험 53,892 데이터 포인트를 생성합니다. SeeGH 수직 염색체 위치를 5,6에 부합되는 각 BAC 대상에서 2 샘플 사이의 log2 신호 강도 비율을 시각화. SMRT 배열 크기 7 50킬로바이트만큼 작은 변경을 감지할 수 있습니다. SMRT의 배열은 DNA의 수익, 손실, amplifications 및 homozygous 삭제를 포함한 DNA를 다시 정리하기의 다양한 행사를 검색할 수 있습니다. SMRT 배열의 독특한 장점은 하나 포르말린 고정 파라핀 임베디드 샘플에서 DNA 격리를 사용할 수있다는 것입니다. unamplified DNA (25 - 100ng)의 낮은 입력 요구 사항과 결합하면이 같은 microdissection 7,8에 의해 만들어진 것과 같은 귀중한 샘플 프로파일 수 있습니다. 이것은 충분한 레이블 샘플의 바인딩이 검출을위한 신호를 생성하실 수 있습니다 각 BAC의 하이브리드화 대상의 대형에 따라 결정됩니다. 이 플랫폼의 또 다른 장점은 지루한 조직 microdissection 8의 필요성을 감소, 조직 이질의 오차이다. 이 비디오 프로토콜은 전체 게놈의 기와 경로 SMRT 배열에 대한 인수를 신호까지 입력 DNA를 라벨의 단계별 자습서입니다.
Protocol
프로브 라벨
참고 : 항상 빛을 Cye 염료의 한계 노출 (이것은 어두운 공간에서 근무하거나 같은 알루미늄 호일로 커버와 튜브를 차폐하여 얻을 수 있습니다)
- 컴바인 :
(샘플에 대한 참조 1 반응 관에 대한 설정 1 반응 튜브)- DNA (25-400 NG)
- 배 무작위 primers 버퍼 5 μL (최종 농도 : 5 배 Promega Klenow 버퍼 7 μg / μL 무작위 octamers)
- 소주 H 2 O와 17.0 μL 전체 볼륨을 희석
- 100 10 분 보일 ° C. 1 분 얼음 즉시 전송합니다.
- 10X dNTP 믹스 (2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP) 4 μL를 추가합니다.
- CyeDyes 추가 :
- 샘플 DNA에 싸이 - 3 분류 dCTP 2 μL (2 nmoles) 추가
- 참조 DNA (예를 들어, Novagen 인간 게놈의 DNA)에 싸이 - 5 분류 dCTP 2 μL (2 nmoles) 추가
- 2.5 Klenow의 μL (9 U / μL, Promega)와 혼합을 추가합니다.
- 37 품어 ° C 야간 * (~ 18 시간).
* 숙박 하이브 리다이 제이션 시간이 부정적인 실험실 일정에 맞게 라벨 과정에 영향을주지 않고 14~24시간 사이에 조정할 수 있습니다.
샘플 정리
(하이브 리다이 제이션에 대한 조사 정리 및 준비 결합)
- Microcon YM - 30 컬럼을 사용 :
- 100 μL 콧 - 1 DNA (1μg/μL) 열에 추가합니다. 피펫 팁과 멤브레인를 만지지 마십시오.
- 풀 반응 (참조 및 샘플)과 열을 추가할 수 있습니다.
- 10 분 1만3천g에서 제공 관과 스핀에 넣어 칼럼.
- 멤브레인 200 μL 소주 H 2 0를 추가하고 씻어 스핀을 반복합니다.
- 튜브를 취소 45 μL 하이브 리다이 제이션 솔루션을 추가합니다 (로체 파다 쉬운)
- 반전 Microcon, 새 라벨 관에서 개최하고, 3 분 3,000그램에 스핀.
INCORPORATIONS 계산
- 1.5 μL와 NanoDrop 분광를 사용하여 측정 형광단의 설립을 제거합니다. 빈 (파고 쉬운)로 하이브 리다이 제이션 버퍼를 사용하면 화면에 나타나는 지시를 따릅니다. (필요한 경우는 측정 후, 받침대에서 샘플을 복구할 수 있습니다.)
(참고 :. 3.0 pmol / μL 어느 채널에 아래 Incorporations 변수 결과를 보였습니다) - 85에서 변성 ° C 10 분.
- 45 플레이스 프로브 ° C 30 분 1 시간 (콧 - 1 DNA가 어닐링 수 있습니다.)에 대한
배열 하이브 리다이 제이션
- coverslip에 플레이스 44 μL 프로브 솔루션 (22mm X 60mm) (피셔 과학). 가능한 경우, 슬라이드에 coverslip을 배치 따뜻한 또는 열 블록 ° C 온도를 유지하기 위해 45 미리 예열.
- coverslip 및 프로브 솔루션을 통해 슬라이드, 하이브 리다이 제이션 용액과 접촉을 허용하는 슬라이드의 하단 한쪽 가장자리를 맞춥니다. coverslip이 표면 장력으로 슬라이드에 첨부 때까지 낮은 계속. 슬라이드를 반전.
- 하이브 리다이 제이션 카세트 (Telechem)에 슬라이드를 삽입, 45 미리 예열 ° C, 그리고 낮은 홈 (하이브리드화 중에 습도를 제어하는)에 물 10 μL를 추가합니다.
- 36 시일 카세트 및 부화 - 45 40시간 ° C.
배열 워싱
참고 : 모든 세척 솔루션 산도 7.0에 있습니다
하이브 리다이 제이션 카세트에서 슬라이드의 제거 중요합니다. 디그 쉬운 신속하게 상온에서 구체화될. 슬라이드 바로 포장되어 및 커버 슬립은 씻어 솔루션에서 제거되어야합니다.
- 약 60 0.1XSSC의 ML, 0.1 % SDS (산도 7.0, 45 ° C) 하이브리드화 챔버를 개방하기 전에 코플린 병 솔루션을 씻으십시오. 추가
- 오픈 챔버는 솔루션을 씻고 coverslip을 (그것이 밀어한다) 제거하는 슬라이드를 추가합니다.
- ° C 일분 각 동요와 슬라이드에게 0.1XSSC 3 회 + 45 0.1 % SDS 씻으십시오.
- 신선한 0.1XSSC에서 슬라이드 3 번이나 씻어 *. 표시 SDS 세척부터 잔여 거품이 없어야합니다.
* 슬라이드 원심 분리기 및 (~ 15 분) 검사 준비가 될 때까지 최종 세척 용액에 남아있을 수 있습니다. - 3 분 700g에 50 ML 팔콘 튜브에서 슬라이드를 원심 분리기.
- 즉시 (신호 강도가 시간이 지남에 따라 감소됩니다.) 슬라이드를 스캔
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Discussion
불쌍한 품질 DNA 좋은 하이브리드화 프로필을 제공하지 않습니다. 그것은 샘플을 보장하기 위해 필수적이며, 참조 DNA는 페놀, RNA, 소금, 하이브 리다이 제이션 실험을 시작하기 전에 임의의 주요 상표 단계에 방해가 될 수 등으로 오염 물질에서 무료입니다. 예를 들어 트리스에서 DNA의 resuspension - 대신 물 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TE)가 높은 소금 농도로 사용하지 않는 것이 좋습니다는 상표 반응을 억제하실 수 있습니다. 우리는 DNA의 수량뿐만 아니라 전반적인 흡광 곡선의 모양과 280분의 260, 230분의 260 비율을 모두 측정하는 Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 DNA의 품질을 시금 것이 좋습니다.
워싱 : 발굴 쉬운 하이브 리다이 제이션 솔루션은 매우 빠르게화될으로 하이브리드화 카세트에서 슬라이드를 제거하고 온수 세척 솔루션에 전송하면 하이브 리다이 제이션 프로세스에서 중요한 단계입니다. 그것은 씻어 솔루션 중립적인 산도에서하는 것이 중요하며 언바운드 프로브를 제거하는 동안 세척 솔루션의 온도는 엄중 중요합니다. 슬라이드를 건조 후 바로 스캔하지 않을 경우, 또는 나중에 그들을 다시 검색하고자하는 경우 스캔 후 어둠 속에서 그들을 유지하는 것이 중요합니다.
오존 : 배열 CGH를 수행할 때 오존이 세계적인 우려를하고 있습니다. 5ppm 이상의 오존 수준은 Cye 염료를 부정 영향을 보여왔다. Cye 5 오존 저하에 특히 민감합니다. 오존 노출을 최소화하는 것은 Cye 색소 저하 및 스캔 전과 도중에 신호의 손실을 방지하는 열쇠입니다. 예를 들어 야간에 검사, 환경 오존은 일반적으로 낮은 경우 하나의 가능한 옵션입니다. 세탁 및 스캔 자동 슬라이드 및 다양한 화학 슬라이드 트리 트먼트에 대한 오존 무료 엔클로저 상업적으로 사용할 수 있습니다. 오존 저항 Cye의 염료는 또한 최근에 개발되었습니다.
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Acknowledgments
우리는이 문서의 준비 완 램 랩 BAC 배열 팀은 특히 미와 스즈키와 브라이언 치의 회원 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구, 게놈 캐나다 / 게놈 브리티시 컬럼비아, 그리고 NIH / NIDCR 부여 RO1 DE15965 - 01에 대한 캐나다 연구소에서 자금을 지원했다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
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