Summary
Это видео является техническая демонстрация гибридизации протокол для целого генома плитки путь массив CGH, который сканирует весь геном человека, используя только 25-100 нг ДНК, которые могут быть выделены из различных источников, в том числе архивных фиксированных формалином материал.
Abstract
Массив сравнительной геномной гибридизации (CGH массив) является методом для выявления выгод и потерь от сегменты ДНК или дозы генов в геноме 1. Последние достижения в этой технологии позволили высокое разрешение сравнения целых геномов для идентификации генетических изменений у онкологических и других генетических заболеваний 2. Суб-Megabase Резолюция Черепица набора массива (или SMRT) массив состоит из набора около 30 тысяч перекрытия бактериальные искусственные хромосомы (BAC) клонов, которые охватывают генома человека в ~ 100 пар kilobase (кб) сегментов 2. Эти BAC цели индивидуально синтезированы и с пятнами в двух экземплярах, на одном предметном стекле 2-4. Массив CGH основан на принципе конкурентного гибридизации. Выборка и ссылки ДНК дифференциально помечены цианиновых-3 и цианиновых-5 флуоресцентные красители, и со-гибридизации с массивом. После инкубационного периода, несвязанные образцы отмывали от слайдов и массив образ. В свободном доступе пользовательский пакет программного обеспечения под названием SeeGH (www.flintbox.ca) используется для обработки больших объемов данных, собранных - одного эксперимента генерирует 53 892 точек данных. SeeGH визуализирует интенсивности сигнала log2 соотношение между 2 пробы в каждой целевой концентрации алкоголя в крови которого вертикально с хромосомными позиции 5,6. Массив SMRT может обнаружить изменения как малые, как 50 КБ 7. Массив SMRT может обнаружить различные ДНК перестановки событий, включая ДНК, прибыли, убытки, усилений и гомозиготных делеций. Уникальное преимущество массива SMRT является то, что можно использовать ДНК, выделенной из фиксированных формалином и залитые парафином образцов. В сочетании с низкими требованиями к входу неусиленных ДНК (25-100ng) это позволяет профилирования драгоценных образцов, таких как, производимые микродиссекции 7,8. Это объясняется большой размер каждой целевой BAC гибридизации, который позволяет связывание меченых образцов достаточное для получения сигналов для обнаружения. Еще одним преимуществом этой платформы является толерантность тканей неоднородности, уменьшая необходимость в утомительной микродиссекции ткани 8. Это видео протокол шаг за шагом учебник от маркировки входных ДНК до получения сигнала для целого ряда плитки генома SMRT пути.
Protocol
PROBE МАРКИРОВКА
Примечание: воздействия в Cye Красители на свет в любое время (это может быть достигнуто за счет работы в затемненной области или экранирование труб с крышкой, таких как алюминиевая фольга)
- Комбинат:
(Setup 1 реакционную трубку для сведения и в 1 реакционную трубку для образца)- ДНК (25-400 нг)
- 5 мкл 5X буфера случайных праймеров (Конечная концентрация: 5X Promega Кленова буфера и 7 мкг / мкл случайных octamers)
- Развести до 17,0 мкл общего объема дистиллированной H 2 O
- Варить в течение 10 минут при температуре 100 ° C. Передача сразу на лед в течение 1 минуты.
- Добавьте 4 мкл 10X смесь дНТФ (2 мм дАТФ, дГТФ, dTTP, 1.2мм дЦТФ).
- Добавить CyeDyes:
- Добавьте 2 мкл (2 нмоль) Су-3 помечены дЦТФ к образцу ДНК
- Добавьте 2 мкл (2 нмоль) Су-5 помечены дЦТФ Ссылка ДНК (например, Novagen геномной ДНК человека)
- Добавить 2,5 мкл Кленова (9 ед / мкл, Promega) и перемешать.
- Инкубировать при 37 ° С в течение ночи * (~ 18 часов).
* Ночь времени гибридизации можно регулировать в пределах от 14 до 24 часов без ущерба для процесса маркировки в соответствии с графиком лаборатории.
ОБРАЗЕЦ ОЧИСТКА
(Комбинированный датчик очистке и подготовке к гибридизации)
- Использование микроконтроллер YM-30 колонке:
- Добавить 100 мкл Кот-1 ДНК (1μg/μL) на колонке. Не прикасайтесь к мембране с пипетки.
- Бассейн реакции (справочно-образец) и добавить к колонке.
- Место столбца в условии, трубки и спина при 13000 г в течение 10 минут.
- Добавить 200 мкл дистиллированной H 2 0 к мембране и повторить спина мыть.
- Отменить трубки и добавить 45 мкл раствора гибридизации: (Roche DIG Easy)
- Обратить микроконтроллер, место в новой помечены трубки, и спина в 3000 г в течение 3 минут.
РАСЧЕТ инкорпорации
- Удалить 1,5 мкл и измерить флуорофора включения использованием NanoDrop спектрофотометр. Использование гибридизации буфер пуст (DIG Easy) следуйте указаниям на экране. (Вы можете восстановить образца с пьедестала, при необходимости, после измерения.)
(Примечание:. Инкорпорации ниже 3,0 пмоль / мкл в любом канале показали разные результаты) - Денатурации при 85 ° С в течение 10 минут.
- Место зонд при 45 ° С в течение 30 минут до 1 часа (позволяет Кот-1 ДНК отжига.)
ARRAY ГИБРИДИЗАЦИЯ
- Место 44 мкл решение зонд на покровное (22 мм х 60 мм) (Fisher Scientific). Если возможно, поместите покровное на слайде теплее или тепла блока предварительно нагревают до 45 ° С для поддержания температуры.
- Совместите скользить по покровное и зонда решение, нижний край слайда позволяет связаться с гибридизации решение. Продолжайте ниже, пока покровное прилагается к слайду с поверхностным натяжением. Обратить слайда.
- Место скользить в гибридизации кассета (Telechem), предварительно нагревают до 45 ° С, и добавить 10 мкл воды в нижний паз (для контроля влажности при гибридизации).
- Кассета Печать и инкубировать в течение 36 - 40 часов при 45 ° C.
ARRAY СТИРАЛЬНЫЕ
Примечание: Все мыть решения при рН 7,0
Удаление слайда из гибридизации кассета имеет решающее значение. DIG Легкая быстро кристаллизуется при комнатной температуре. Слайд должен быть немедленно окунуться и покровное стекло снимается в промывочного раствора.
- Добавьте примерно 60 мл 0.1XSSC, 0,1% SDS (7,0 рН, 45 ° C) промывочного раствора в банке Коплин до открытия гибридизации камеры.
- Открытая камера, добавить слайд мыть раствором и удалить покровное (она должна соскальзывать).
- Вымойте слайд 3 раза в 0.1XSSC + 0,1% SDS при 45 ° С в течение 1 минуты каждый с волнением.
- Промыть слайд 3 раза в пресной 0.1XSSC *. Там должно быть никаких остаточных пузырьков от мытья SDS видно.
* Слайды может оставаться в финале промывочного раствора до готовности к центрифуге и сканирования (~ 15 минут). - Центрифуга слайда в 50 мл труб Сокол на 700 г в течение 3 минут.
- Сразу сканировать слайды (сигнал интенсивности будет уменьшаться с течением времени.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Низкое качество ДНК не будет обеспечивать хороший профиль гибридизации. Важно, чтобы образцов и эталонов ДНК свободными от загрязняющих веществ, таких как фенол, РНК, соль и т.д., которые могут помешать случайные премьер шаг маркировки до начала гибридизации эксперимента. Например ресуспендирования ДНК в Трис - ЭДТА (TE) вместо воды не рекомендуется, поскольку высокая концентрация соли может ингибировать маркировки реакции. Мы рекомендуем опробование ДНК качества с использованием Nanodrop спектрофотометр для измерения как ДНК количество, а также общая форма кривой поглощения и 260/280, 260/230 отношение.
Стиральные: Удаление слайда из гибридизации кассеты и передаче подогревом промывочного раствора является важным шагом в процессе гибридизации, как DIG простое решение гибридизации кристаллизуется очень быстро. Важно, чтобы вымыть решения быть нейтральным рН и температуры промывочного раствора важна для строгость, удаляя несвязанного зонда. После высыхания слайды важно, чтобы держать их в темноте, если не выполняется сразу же, или после сканирования, если вы хотите провести повторную проверку их на более позднее время.
Озон: озон была обеспокоенность во всем мире при выполнении массив CGH. Озон уровней выше 5ppm Было показано, что отрицательно влияет на Cye красителей. Cye 5 Особенно чувствительны к озону, деградации. Минимизация воздействия озона является ключом к предотвращению Cye красителя деградации и потери сигнала до и во время сканирования. Сканирование в ночное время, например, когда экологические озона, как правило, ниже, является одним из возможных вариантов. Озон свободных корпусов для автоматизированного слайд мойки и сканирования и лечения различных химических слайд имеются в продаже. Озон устойчивыми красителями Cye также недавно был разработан.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить членов Ван Лам Лаборатории BAC массива команда особенно Мива Suzuki и Брайан Чи для подготовки этой статьи. Работа выполнена при поддержке за счет средств канадского института исследований в области здравоохранения, Геном Канада / Геном Британской Колумбии, и NIH / NIDCR грант RO1 DE15965-01.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
