Summary
Den här videon är en teknisk demonstration av hybridisering protokoll för hela genomet kakel väg array CGH som läser av hela det mänskliga genomet med bara 25-100 ng DNA som kan isoleras från en mängd källor, bland annat arkivens formalin fasta material.
Abstract
Array jämförande genomik hybridisering (matris CGH) är en metod för att upptäcka vinster och förluster av DNA-segment eller genen dosering i genomet 1. Senaste framstegen inom denna teknik har möjliggjort hög upplösning jämförelse av hela genomet för att identifiera genetiska förändringar i cancer och andra genetiska sjukdomar 2. Sub-Megabase Upplösning Plattsättning-set array (eller SMRT) uppsättning består av en uppsättning av ca 30 tusen överlappande bakteriell konstgjord kromosom (BAC) kloner som spänner över det mänskliga genomet i ~ 100 kilobase par (kb) segment 2. Dessa BAC mål är individuellt syntetiseras och fläckiga i två exemplar på en enda glasskiva 2-4. Array CGH bygger på principen om konkurrerande hybridisering. Prov och referens DNA differentiellt märkta med Cyanine-3 och Cyanine-5 fluorescerande färger, och co-hybridiseras till i arrayen. Efter en inkubationstid på obundna proverna tvättas bort från bilden och arrayen avbildas. En fritt tillgänglig anpassad programpaket som kallas SeeGH (www.flintbox.ca) används för att bearbeta den stora mängd uppgifter som samlats in - ett enda experiment genererar 53.892 datapunkter. SeeGH visualiserar log2 förhållandet signalstyrkan mellan två prover vid varje BAC mål som vertikalt är i linje med kromosomala läge 5,6. Den SMRT array kan upptäcka förändringar så små som 50 kb i storlek 7. Den SMRT array kan upptäcka en rad olika evenemang DNA ombildning inklusive DNA vinster, förluster, förstärkningar och homozygota deletioner. En unik fördel med SMRT matrisen är att man kan använda DNA isolerat från formalinfixerade fast inbäddade paraffin prover. I kombination med den låga ingången krav oförstärkta DNA (25-100 ng) Detta gör att profilering av dyrbara prover som de som produceras av microdissection 7,8. Detta tillskrivs den stora storleken på varje BAC hybridisering mål som gör att bindningen av tillräckligt märkta prover för att producera signaler för upptäckt. En annan fördel med denna plattform är toleransen av vävnad heterogenitet, vilket minskar behovet av tråkiga vävnad microdissection 8. Denna video protokoll är en steg-för-steg anvisning från märkning ingången DNA genom att signalera förvärvet för hela genomet kaklet väg SMRT array.
Protocol
PROBE ETIKETTERING
OBS: begränsa exponering av CYE Färgämnen för ljus hela tiden (detta kan uppnås genom att arbeta i ett mörklagt område eller genom att skydda rör med ett lock som aluminiumfolie)
- Kombinera:
(Inställning 1 reaktionsrör för referens och ett reaktionsrör för prov)- DNA (25-400 ng)
- 5 mikroliter av 5X random primers buffert (Slutlig koncentration: 5x Promega Klenow buffert och 7 mikrogram / mikroliter random octamers)
- Späd till 17,0 mikroliter totala volymen med destillerat H 2 O
- Koka i 10 minuter vid 100 ° C. Överför omedelbart till is under 1 minut.
- Tillsätt 4 mikroliter 10X dNTP mix (2mm dATP, dGTP, dTTP, 1,2 dCTP).
- Lägg CyeDyes:
- Tillsätt 2 mikroliter (2 nmoles) av Cy-3 märkt dCTP till prov-DNA
- Tillsätt 2 mikroliter (2 nmoles) av Cy-5 märkt dCTP på Referens DNA (t.ex. Novagen mänsklig genomisk DNA)
- Tillsätt 2,5 mikroliter av Klenow (9 U / mikroliter, Promega) och blanda.
- Inkubera vid 37 ° C över natten * (~ 18 timmar).
* Den natten hybridisering tiden kan justeras mellan 14 till 24 timmar utan att negativt påverka märkningen processen för att passa till ett laboratorium schema.
EXEMPEL CLEAN UP
(Kombinerad givare sanering och förberedelse för hybridisering)
- Med hjälp av en Microcon YM-30 kolumn:
- Tillsätt 100 mikroliter Cot-1 DNA (1μg/μL) till kolumn. Rör inte membranet med pipettspetsen.
- Pool reaktioner (referens-och prov) och lägga till kolumn.
- Placera kolonnen, under förutsättning röret och snurra på 13 tusen gi 10 minuter.
- Tillsätt 200 mikroliter destillerat H 2 0 till membranet och upprepa snurra att tvätta.
- Kasta röret och tillsätt 45 mikroliter hybridisering lösning: (Roche DIG Lätt)
- Invertera Microcon, placera i en märkt nya rör och snurra vid 3000 g under 3 minuter.
BERÄKNING AV inkorporeringar
- Ta bort 1,5 mikroliter och mäta fluoroforen införlivande med NanoDrop spektrofotometer. Använda hybridisering buffert som en tom (DIG Easy) följ anvisningarna på skärmen. (Du kan återställa provet från piedestalen, vid behov efter mätning.)
(Obs:. Inkorporeringar under 3,0 pmol / mikroliter antingen kanal har visat varierande resultat) - Denaturera vid 85 ° C i 10 minuter.
- Placera sond vid 45 ° C i 30 minuter till 1 timme (tillåter Cot-1 DNA glödgning.)
ARRAY hybridisering
- Sätt 44 mikroliter sond lösning på täckglas (22 mm x 60 mm) (Fisher Scientific). Om tillgängligt, placera täckglas på en bild varmare eller värmeblock förvärmas till 45 ° C för att bibehålla temperaturen.
- Passa glida över täckglas och sond lösning, lägre ena kanten av bilden så att kontakten med hybridisering lösningen. Fortsätt att sänka tills täckglas är kopplad till bilden med ytspänning. Invertera bild.
- Placera glida in hybridisering kassett (Telechem), förvärmas till 45 ° C, och tillsätt 10 mikroliter av vatten i den nedre spåret (för att styra luftfuktigheten under hybridisering).
- Seal kassett och inkubera för 36 - 40 timmar vid 45 ° C.
ARRAY TVÄTT
OBS: Alla tvätta lösningar vid pH 7,0
Borttagning av bilden från hybridisering kassetten är kritisk. DIG Lätt kristalliserar snabbt vid rumstemperatur. Bilden bör omedelbart nedsänkt och locket glider bort i tvättlösning.
- Tillsätt ca 60 ml 0.1XSSC, 0,1% SDS (pH 7,0, 45 ° C) tvätta lösning till ett Coplin burk innan du öppnar hybridisering kammaren.
- Öppen kammare, lägga bilden för att tvätta lösning och ta bort täckglas (den ska glida av).
- Tvätta bilden 3 gånger i 0.1XSSC + 0,1% SDS vid 45 ° C under 1 minut vardera med agitation.
- Skölj bilden 3 gånger i färskt 0.1XSSC *. Det bör inte finnas några rester bubblor från SDS tvätta synlig.
* Bilderna kan vara kvar i den slutliga tvättlösning tills den ska centrifug och skanna (~ 15 minuter). - Centrifugera bilden i en 50 ml Falcon rör vid 700 gi 3 minuter.
- Omedelbart skanna diabilder (signal intensiteten kommer att minska med tiden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dålig kvalitet DNA kommer inte att ge en bra hybridisering profil. Det är viktigt att säkerställa att prov och referens-DNA är fria från föroreningar som fenol, RNA, salt, etc som kan störa slumpmässiga främsta märkning steget innan en hybridisering experiment. Till exempel på resuspension av DNA i Tris - EDTA (TE) i stället för vatten rekommenderas inte så hög saltkoncentration kan hämma märkning reaktion. Vi rekommenderar testmetoder för DNA-kvalitet med Nanodrop spektrofotometer för att mäta både DNA-mängd samt övergripande formen absorbans kurvan och 260/280, 260/230 förhållandet.
Tvätt: Ta bort bilden från hybridisering kassett och överförs till den uppvärmda tvättlösning är ett kritiskt steg i hybridisering process som DIG Easy hybridisering lösning kristalliserar mycket snabbt. Det är viktigt att tvätta lösningar på ett neutralt pH och temperaturen på tvättlösningen är viktigt för stringens och ta av den obundna sonden. Efter torkning bilder är det viktigt att hålla dem i mörkret om inte söker direkt, eller efter skanning om du vill söka igenom dem vid ett senare tillfälle.
Ozon: har ett världsomspännande problem när de utför array CGH. Ozonhalter över 5ppm har visat sig inverka negativt på CYE färgämnen. CYE 5 är särskilt känslig för ozon nedbrytning. Minimera exponering för ozon är nyckeln till att förebygga CYE färga nedbrytning och förlust av signal före och under skanning. Scanning på natten till exempel när miljö ozon är normalt lägre, är ett möjligt alternativ. Ozon gratis kapslingar för automatiserad bild tvätt och skanning och olika kemiska behandlingar bild finns kommersiellt tillgängliga. Ozon resistenta CYE färgämnen har också nyligen tagits fram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Wan Lam Lab BAC Array laget speciellt Miwa Suzuki och Bryan Chi för utarbetandet av denna artikel. Detta arbete stöddes av medel från kanadensiska Institutes for Health Research, Genome Canada / Genome British Columbia, och NIH / NIDCR bevilja RO1 DE15965-01.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
