Summary
Bu video için hibridizasyon protokol arşiv formalin sabit malzeme de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan izole edilebilen DNA sadece 25-100 ng kullanarak tüm insan genom taramaları tüm genom döşeme yol Array CGH, teknik bir gösteri.
Abstract
Dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (dizi CGH) DNA segmentlerinin veya gen genom 1 doz kazanç ve kayıpları tespit etmek için bir yöntemdir. Bu teknoloji son gelişmeler, kanser ve diğer genetik hastalıklar 2 genetik değişikliklerin belirlenmesi için tüm genomların yüksek çözünürlüklü karşılaştırma sağlamıştır . Alt Megabase Çözünürlük Fayansları-set bir dizi (veya smrt) bir dizi yaklaşık otuz bin bakteriyel yapay kromozom (BAC) ~ 100 kilobaz çifti insan genomu (kb) segmentleri 2 açıklıklı klonlar örtüşen bir dizi oluşur. Bu BAC hedefler ayrı ayrı sentezlenen ve tek bir cam slayt 2-4 yinelenen fark vardır . Array CGH, rekabet melezleşme ilkesine dayanır. Örnek ve referans DNA Cyanine-3 ile farklı etiketli ve Cyanine-5 floresan boyalar ve dizi co-melezleşmiştir. Bir kuluçka döneminden sonra ilişkisiz örnekleri slayt yıkanır ve dizi görüntülenmiş. SeeGH (www.flintbox.ca) adında bir serbestçe kullanılabilir özel bir yazılım paketi toplanan verilerin büyük hacimli işlem yapmak için kullanılan tek bir deney 53.892 veri noktaları oluşturur. SeeGH dikey kromozomal pozisyonu 5,6 ile uyumlu her BAC hedef 2 örnekleri arasında log2 sinyal yoğunluğu oranı görüntüler. Smrt dizi boyutu 7 50 kb gibi küçük değişiklikler tespit edebilir. Smrt dizi DNA düzenlenmesi olayların DNA kazançları, kayıpları, ilâvelerle ve homozigot silmelerine da dahil olmak üzere çeşitli algılayabilir. Smrt dizi benzersiz bir avantaj, bir formalin sabit parafin örneklerinden izole edilen DNA kullanabilirsiniz. Yükseltilmemiş DNA (25-100ng) düşük giriş gereksinimleri ile kombine edildiğinde bu mikrodiseksiyon 7,8 ürettiği gibi değerli örneklerinin profil sağlar. Bu algılama için yeterli etiketli örneklerin bağlayıcı sinyalleri üretmek için izin verir her BAC hibridizasyon hedef büyüklüğü atfedilir. Bu platformun diğer bir avantajı, sıkıcı doku mikrodiseksiyon 8 ihtiyacını azaltarak, doku heterojenite tolerans . Bu video protokolü, tüm genom döşeme yol smrt dizisi için satın sinyal yoluyla giriş DNA etiketleme adım adım öğretici.
Protocol
PROBE ETİKETLEME
Not: her zaman ışık Cye Boyaların maruz kalma (Bu, karanlık bir alanda çalışan ya da alüminyum folyo gibi bir kapak ile tüpler koruyucu tarafından elde edilebilir)
- Birleştirin:
(Örnek için referans ve 1 reaksiyon tüpü Kur 1 reaksiyon tüpü)- DNA (25-400 ng)
- 5X rastgele primerler tampon 5 mcL (Final konsantrasyonu: 5X Promega Klenow tampon ve 7 mg / mcL rastgele octamers)
- Distile H 2 O ile 17.0 mcL toplam hacmi ile seyreltilir
- 100 az 10 dakika kaynatın ° C 1 dakika boyunca buz hemen aktarın.
- 10X dNTP karışımı (2mm dATP, dGTP, dTTP, 1.2mm dCTP) 4 mcL ekleyin.
- CyeDyes ekle:
- Örnek DNA Cy-3 etiketli dCTP 2 mcL (2 nmoles)
- Referans DNA (örneğin, Novagen insan genomik DNA) Cy-5 etiketli dCTP 2 mcL (2 nmoles)
- 2.5 Klenow mcL (9 U / mcL, Promega) ve karışımı ekleyin.
- 37 ° ° C'de bir gecede * (~ 18 saat).
* Gecede hibridizasyon zaman olumsuz bir laboratuvar programı uygun etiketleme sürecini etkileyen olmadan 14 ila 24 saat arasında ayarlanabilir.
Temizlik ÖRNEK UP
(Hibridizasyon için prob temizleme ve hazırlık Kombine)
- Microcon YM-30 sütun kullanma:
- 100 mcL Cot-1 DNA (1μg/μL) sütun ekleyin. Pipet ile membran dokunmayın.
- Havuzu reaksiyonlar (referans ve örnek) ve sütun eklemek.
- 13000 g 10 dakika boyunca verilen tüp ve spin yerleştirin sütun.
- 200 mcL distile H 2 0 zarı ekleyin ve tekrar yıkama sıkma.
- Tüp atılır ve 45 mcL hibridizasyon çözüm ekleyin: (Roche DIG Kolay)
- Haricindekileri Microcon, etiketli yeni bir tüp yer ve 3 dakika 3000 g spin.
Kurumlar VE HESAPLANMASI
- 1.5 mcL ve ölçü fluorofor dahil NanoDrop Spektrofotometre kullanarak çıkarın. Boş (DİJİTAL Kolay) olarak hibridizasyon tampon kullanarak ekrandaki yönergeleri izleyin. (Gerekirse ölçümünden sonra, kaide örnek kurtarmak.)
(Not: her iki kanalda 3.0 pmol / mcL altında Kurumlar değişken sonuçlar göstermiştir ) - 85 doğasını ° C'de 10 dakika.
- Yeri prob (45 ° C) 30 dakika ile 1 saat (Cot-1 DNA tavlama sağlar.)
ARRAY Melezleme
- Lamel üzerine yerleştirin 44 mcL prob çözüm (22 mm x 60 mm) (Fisher Scientific). Varsa, bir slayt lamel sıcak veya ısı bloğu ile 45 ° C sıcaklıkta korumak için önceden ısıtılmış.
- Lamel ve prob çözüm üzerinde slayt, slayt hibridizasyon solüsyonu ile temas sağlayan düşük bir kenarı aynı hizaya getirin. Lamel, yüzey gerilimi ile slayt bağlı olduğu kadar düşürmek için devam edin. Slayt haricindekileri.
- Hibridizasyon kaset (Telechem) içine Slayt koyun, 45 önceden ısıtılmış ° C ve alt oluk (hibridizasyon sırasında nem kontrolü) 10 mcL su ekleyin.
- Seal kaset ve inkübe 36 - 40 saat 45 ° C
ARRAY YIKAMA
Not: Tüm yıkama solüsyonları, pH 7.0
Hibridizasyon kaset slayt çıkarılması önemlidir. DIG Kolay oda sıcaklığında hızla kristalleşir. Slayt hemen dalmış ve kapak kayma yıkama solüsyonu kaldırıldı olmalıdır.
- Yaklaşık 60 0.1XSSC ml,% 0.1 SDS (pH 7.0, 45 ° C) hibridizasyon odasının açılışı öncesinde bir Coplin kavanoz çözüm yıkayın.
- Açık odası, çözüm yıkayın ve lamel (kaydırarak) kaldırmak için slayt eklemek.
- 3 kez 0.1XSSC +% 0.1 SDS 45 ° C her biri 1 dakika ajitasyon ile slayt yıkayın.
- 3 kez taze 0.1XSSC slayt durulayın *. SDS yıkama görünür hiçbir kalıntı kabarcıklar olmalıdır.
* Slaytlar, santrifüj ve tarama (~ 15 dakika) hazır olana kadar son yıkama solüsyonu kalır. - 3 dakika boyunca 700 g, 50 ml Falcon tüpler slayt santrifüjleyin.
- Hemen (sinyal yoğunlukları zaman içinde azalacaktır.) Slaytları tarama
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Düşük kaliteli DNA iyi bir melezleşme profili vermeyecektir. O örnek sağlamak için gereklidir ve referans DNA, fenol, RNA, tuz, hibridizasyon deney başlamadan önce rasgele asal etiketleme adım müdahale vb gibi kirleticilerden uzak. Örneğin Tris DNA tabanda su yerine EDTA (TE), yüksek tuz konsantrasyonu tavsiye edilmez etiketleme reaksiyonu engelleyebilir. DNA miktarı yanı sıra genel absorbans eğrisinin şekli ve 260/280, 260/230 oranı ölçmek için Nanodrop spektrofotometre kullanılarak DNA kalitesi assaying öneririz.
Yıkama: DIG Kolay hibridizasyon çözümü çok çabuk kristalleşir slayt hibridizasyon kaset çıkarma ve ısıtmalı yıkama solüsyonu transfer hibridizasyon sürecinde kritik bir adımdır. Yıkama çözümleri bir nötr pH önemli olduğunu ve ilişkisiz prob çıkarırken yıkama çözeltisi sıcaklığı darlığı için önemlidir. Slaytlar Kuruduktan sonra hemen taramıyorsanız, ya da bunları daha sonraki bir zamanda yeniden taramak istiyorsanız taramadan sonra karanlıkta onları tutmak için önemlidir.
Ozon: Array CGH yaparken Ozon dünya çapında bir endişe kaynağı olmuştur. 5ppm yukarıda Ozon düzeyleri Cye boyaların olumsuz etkiler görülmüştür. Cye 5 ozon bozulmaya karşı özellikle duyarlıdır. Ozon en aza indirmek Cye boya bozulması ve taramadan önce ve sırasında sinyal kaybı önlemek için anahtar. Örneğin geceleri Tarama, çevre ozon genellikle düşük olduğunda, olası bir seçenektir. Ozon ücretsiz muhafazaları yıkama ve tarama otomatik slayt ve çeşitli kimyasal slayt tedavisi için ticari olarak kullanılabilir. Ozon dayanıklı Cye boyalar yakın zamanda geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz bu makalenin hazırlanması için Wan Lam Lab BAC Dizi ekibi özellikle Miwa Suzuki ve Bryan Chi üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Sağlık Araştırma, Genom Kanada / Genom British Columbia, NIH / NIDCR hibe RO1 DE15965-01 Kanada Enstitüleri fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
