Summary
Övervakningen av extracellulära neurotransmittorn nivåer i olika områden i hjärnan av fritt flytta djur ger insikter om sambandet mellan frisättningen av neurotransmittorer och beteende. In vivo mikrodialys i kombination med elektrokemisk detektion ger utmärkt anatomiska och kemiska upplösning, och information om hur basala neurotransmissionen ändras genom farmakologiska eller fysiologiska manipulationer.
Abstract
Förmågan att mäta extracellulära basala nivåer av signalsubstanser i hjärnan hos vakna djur gör det möjligt för bestämning av effekterna av olika systemiska utmaningar (farmakologisk eller fysiologiska) till CNS. Till exempel kan man mäta direkt hur djurets mitthjärnan dopamin prognoser svara på dopamin-frisättande läkemedel som d-amfetamin eller naturliga stimuli såsom mat. I denna video visar vi hur du implantat vägleda kanyler inriktas på specifika platser i råtta hjärnan, hur du infogar och implantat en mikrodialys sond och hur du använder höga kromatografi prestanda vätska i kombination med elektrokemisk detektion (HPLC-EG) för att mäta extracellulära nivåer av oxiderbara signalsubstanser och metaboliter. Lokala exakt införandet av droger genom mikrodialys sond möjliggör förfinad arbete på plats specificitet i en sammansatt s verkningsmekanism. Denna teknik har utmärkta anatomiska och kemiska upplösning men bara blygsamma tidsupplösning som mikrodialys prover brukar behandlas varje 20-30 minuter för att se till detekterbara signalsubstansen nivåer. Kompletterande ex vivo-verktyg (dvs, skiva och cellodling elektrofysiologi) kan hjälpa till med övervakning i realtid neurotransmission.
Protocol
Sammanfattning
Två månader gammal medelålder C57BL/6J möss eller motsvarande eller tre månader gammal medelålder Sprague Dawley råttor eller motsvarande bedövas med ketamin (60 mg / kg ip för råtta, 100 mg / kg ip för möss) och xylazin (10 mg / kg, ip för antingen arter). Sedering övervakas med en mjuk tå nypa tillbaka reflex visats i Walantus et al. (Jove, 6, 2007) och Szot et al. (Jove, 9, 2007). Värmereglering kan ske genom en thermostatregulated värmedyna (ALA Instruments Inc.) och övervakas genom en rektal termometer. Huvudet är rakat av päls och rengöras med jod innan snitt. Efter att huden snitt (2 cm lång för råttor, 1 cm långa för möss) och avlägsnande av alla mjukvävnad från ytan av skallen, är placeringen av guiden kanyl bestämmas i förhållande till bregma. Ett 6 mm hål borras genom skallen med en batteridriven borraren avsedd för gnagare kirurgi (Fine Science Tools, Inc.). Man ser till så att borret inte tränga igenom meningeal membran eller blodkärl. Skull implanteras med bilateral 5 mm 21 gauge rostfritt axlar stål guide som leder till den bakre kärnan accumbens, dorsala striatum eller prefrontala cortex. Den stereotaxic koordinater är etablerade enligt Franklin och Paxinos, 1997 (Musen Brain i Stereotaxic Koordinater, Academic Press) eller Paxinos och Watson, 2006 (The Rat Brain i Stereotaxic Koordinater, Academic Press). Implantat är säkrade genom dentala cement. En bolusdos av laktat Ringers av 0,9% koksaltlösning ges vid slutet av operationen (5mls SC hos råttor och 1 ml SC hos möss efter vätskor värms till normal kroppstemperatur) för att förhindra uttorkning. Buprenorfin (0.1-0.5mg/kg SC) ges två gånger dagligen och då, på ett behov när det behövs, om djuret verkar vara i smärta. Lokal behandling med antibiotika (bacitracin salva) och systemisk behandling med antibiotika (penicillin 100.000 IE / kg IM var 12 timmar för de första 48 timmarna efter op) ges om postoperativa infektioner uppstå.
Efter operation, är djur i individuella boxar med mat och vatten tillgängligt ad lib. Minst en vecka är tillåtet för återhämtning innan mikrodialys och eutanasi. Efter återhämtningen från operationen, djuren överförs till ett mikrodialys bur och sonder mikrodialys införas, och cementerade i guiden schakt som har installerats under operation. Probe insättning orsakar inte smärta eller obehag på grund av att givaren är förbi hud, muskler och meningeal vävnad genom guiden axeln. Därför är sond insättning görs utan bedövning och alla anestesi-inducerade effekter på neurokemi eller beteende undviks. Vi låter sonderna stabiliseras i 12 timmar och då vi börjar provtagningen var 30 minuter för ytterligare 8-12 timmar beroende på experimentet. Vi bevakar rörelseapparaten djurets beteende via fotoceller eller manuell inspelning av rörelse av försöksledaren. Microdialysate prover injiceras i en High Performance Liquid Chromatography med elektrokemisk detektion (HPLC-EG) instrument för neurokemiska detektion och analys. Vi ser för effekter på basal neurokemi och motorisk beteende. I slutet av försöket djuret avlivas genom en överdos av systemisk ketamin (200 mg / kg ip) och xylazin (20 mg / kg, ip). Då hjärtat är perfusion med 0,9% koksaltlösning följt av 4% paraformaldehyd. Hjärnan tas bort, fryst och skär längs med mikrodialys sonden tarmkanalen för att verifiera korrekt sond placering.
Förfarande
- Sätt upp stereotaxic instrumentet och allt material som behövs. Se till att området och instrument rengörs och steriliseras.
- Raka av päls med elektrisk rakapparat. Gå från öronen för att bara i-mellan ögonen, flytta rakkniv i olika riktningar för att effektivt rent område av päls. Applicera povidine / jod till rakade området men skyddar ögonen från det.
- Montera djuret på stereotaxic apparaten genom att placera örat barer i hörselgången och strama på plats. Montera först det ena örat bar i hörselgången, och sedan hålla den på plats och skjut in det andra örat baren. Du vet att du är på rätt plats när huvudet inte längre kan flyttas i sidled. Säkra munnen med den främre fästet av stereotaxic och se till att huvudet är i nivå med en linjal. Sätt linjalen i vertikalt läge med avseende på stereotaxic instrumentet plattformen och kontrollera att en 90 ° vinkel mellan härskaren och mitten av djurets hårbotten). Bekräfta detta genom stereotaxic instrumentet om det finns en sådan förmåga.
- Gör en främre / bakre snitt i hårbotten med en steril skalpell sträcker sig från lambda att bara emellan ögonen på djuret. Använd steriliserade peanger att nypa bort från huden och hålla snittet öppen. Använda flera sterila bomullspinnar, torka den exponerade skallen ytan.
- Sätt guiden kanylen på dess fäste, hitta bregma på skallen, och placera guiden kanylen rakt över denna plats. Skriv ner främre / bakre och laterala koordinater. Från bregma, hitta rätt koordinater som behövs för placering av din sond med hjälp av stereotaxic Atlas. Placera guiden kanylen till rätt koordinater genom att addera eller subtrahera från bregma. Ta din guide kanyl tills det ligger an mot skallen, och sedan spela in denna ventrala samordna. Gör en penna markerar med en steril penna på denna plats på skallen, det är där du kommer att borrning.
- Ta bort guiden kanylen och sterilisera din borr. Försiktigt borra ett hål i blyerts märket tills du kommer fram bredden på skallen. Kontrollera med guiden kanylen för att se om det skulle rensa hålet utan att vidröra sidorna. Håll borrning och kontroll tills kanylen kan klara på en rak väg. När hålet är gjort, använd en steril nål för att försiktigt punsch meningerna i syfte att möjliggöra fri införandet av kanylen.
- Nästa, med en handborr, göra sex hål för skallen skruvar: två främre till kanylen hålet, två laterala att kanylen hålet och två bakre åt sidorna. Sterilisera sex skruvar och placera dem på skallen tills de är ordentligt förankrade på.
- Rengör guiden kanylen med etanol och koksaltlösning, montera, och sänk den långsamt till rätt ventrala koordinaten. Se till att sidorna inte vidrör och att den går i helt lodrät.
- Placera ankaret skruv medialt och bakom den bakre skallen skruvar och håller den på plats med pincett. Blanda en tunn sats av flytande dentala cement och täcker guiden kanylen, skruvar, och resten av skallen med en steril spatel. Gör en ny sats, tjockare denna gång, och helt täcka området och kanylen och förankra skruv tillräckligt för att säkra den.
- Som cement blir tjockare och innan det stelnar, separera huden från cement-cupen och mögel cementen koppen med spatel för att se till att cement locket är jämn runt och inte irritera huden senare.
- Låt dentala cement för att helt torr innan du tar bort djuret från apparaten. Ta bort peanger. Applicera bacitracin hela vägen runt cementen locket.
- När djuret är utanför stereotaxic instrumentet, injicera den med 0,25 ml penicillin IM (intramuskulär) följt av 1 ml koksaltlösning SC (subkutant).
- Placera djuret i sin egen bur och bevaka den tills den blir medveten innan det återsänds till sitt rum för att återhämta sig.
- Övervaka djur tills de återhämta sig från narkos på operationsdagen och daglig post-op, fram till slutet av försöket, för tecken på infektion och utvärdering av smärta / lidande. Detta inkluderar helger och helgdagar. Låg spontan rörelse, ångest vocalization vid hantering, krökt kroppshållning, diarré, svullnad och ansvarsfrihet området för headmount, och brist på mat / dricka är alla tecken på smärta och ångest. Buprenorfin (0.1-0.5mg/kg SC) administreras två gånger dagligen, och sedan, på ett behov när det behövs, om djuret verkar vara i smärta. Lokal behandling med antibiotika (bacitracin salva) och systemisk behandling med antibiotika (penicillin 100.000 IE / kg IM var 12 timmar för de första 48 timmarna efter op) ges om postoperativa infektioner uppstå. Om något av dessa symtom kvarstår efter administrering av buprenorfin, extra vätska och antibiotikabehandling inom 12 timmar efter kirurgi, är djuret avlivas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo mikrodialys är det bästa sättet för att mäta olika signalsubstanser och metaboliter i olika hjärna platser i ett levande djur. Övervakar dock bara extracellulära nivåer av neurochemicals och det ger inte tidsupplösningen att övervaka exocytos av neurotransmittorer i realtid. Genom en version av den teknik som kallas "net-flux", kan den verkliga signalsubstansen koncentration vid en viss plats beräknas, vilket i sin tur kan ge exakta mätningar av signalsubstansen andelen återupptagshämmare genom plasmamembranet transportörer.
Mikrodialys är perfekt att illustrera skillnader i basala extracellulära signalsubstansen nivåer mellan olika grupper av djur (dvs olika genotyper) och dechiffrera effekter av droger eller andra manipulationer på signalsubstansen release.
Införandet av analyser alternativ till HPLC-EG som kapillär zon elektrofores (CZE) tillsammans med fluorescerande upptäckt har ökat tiden lösa in vivo mikrodialys inom ett par minuter per prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Med stöd av DK065872 (ENP), en Smith Family Foundation Award of Excellence inom biomedicinsk forskning (ENP), F31 DA023760.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
- Bungay, P. M., Newton-Vinson, P., Isele, W., Garris, P. A., Justice, J. B. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. J. Neurochem. 86, 932-946 (2003).
- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N., Creese, I., Hoebel, B. G. Restricted eating with weight loss selectively decreases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and alters dopamine response to amphetamine, morphine and food intake. The Journal of Neuroscience. 15, 6640-6650 (1995).
