Summary
De controle van de extracellulaire neurotransmitter niveaus in verschillende gebieden van de hersenen van vrij bewegende dieren biedt inzichten over het verband tussen neurotransmitters en gedrag. In vivo microdialyse gekoppeld met elektrochemische detectie zorgt voor een uitstekende anatomische en chemische resolutie, en informatie over hoe basale neurotransmissie wordt aangepast door farmacologische of fysiologische manipulaties.
Abstract
De mogelijkheid om extracellulaire basale niveaus van neurotransmitters in de hersenen van de dieren wakker te meten maakt voor de bepaling van de effecten van verschillende systemische problemen (farmacologische of fysiologische) naar het centrale zenuwstelsel. Bijvoorbeeld, kan men direct meten hoe het dier middenhersenen dopamine projecties te reageren op dopamine-releasing drugs zoals d-amfetamine of natuurlijke prikkels, zoals voedsel. In deze video laten we zien hoe u begeleiden canules richten op specifieke plaatsen in de hersenen van de rat implantaat, hoe in te voegen en implantaat een microdialyse probe en hoe high performance vloeistofchromatografie gekoppeld met elektrochemische detectie (HPLC-EG) te gebruiken om de extracellulaire spiegels van meten oxideerbare neurotransmitters en metabolieten. Lokale precieze introductie van drugs door de microdialyse probe zorgt voor verfijnde werk op het terrein specificiteit in mechanisme van een verbinding is van de actie. Deze techniek heeft uitstekende anatomische en chemische resolutie, maar slechts bescheiden tijdsresolutie als microdialyse monsters worden meestal verwerkt elke 20-30 minuten naar detecteerbare neurotransmitter niveaus te garanderen. Aanvullende ex vivo tools (dat wil zeggen, slice en celcultuur elektrofysiologie) kan helpen met het toezicht op real-time neurotransmissie.
Protocol
Overzicht
Twee maanden oud gemiddelde leeftijd C57BL/6J muizen of gelijkwaardig of drie maanden oud gemiddelde leeftijd Sprague Dawley ratten of een gelijkwaardig zijn verdoofd met ketamine (60 mg / kg ip voor ratten; 100 mg / kg ip voor muizen) en xylazine (10 mg / kg, ip voor beide soorten). Sedatie wordt gecontroleerd met behulp van een zachte teen snuifje reflex aangetoond in te trekken Walantus et al.. (Jupiter, 6, 2007) en Szot et al.. (Jupiter, 9, 2007). Thermoregulatie kan worden verstrekt via een thermostatregulated verwarming pad (ALA Instruments Inc) en gecontroleerd via een rectale thermometer. Hoofd wordt geschoren van bont en schoongemaakt met jodium voor de incisie. Na huidincisie (2 cm lang voor ratten, 1 cm lang voor muizen) en het verwijderen van alle weke delen van het oppervlak van de schedel, is plaatsing van de gids canule bepaald ten opzichte van bregma. Een 6 mm gat is geboord door de schedel met een batterij-aangedreven boorder ontworpen voor knaagdier chirurgie (Fine Science Tools, Inc.) Zorg wordt genomen, zodat de boor niet doordringen meningeale membranen of bloedvaten. Schedel is geïmplanteerd met bilaterale 5 mm 21 gauge inox-assen die naar de achterste nucleus accumbens, dorsale striatum of prefrontale cortex. De stereotaxische coördinaten worden ingesteld per Franklin en Paxinos, 1997 (de hersenen van muizen in stereotaxische Coördinaten, Academic Press) of Paxinos en Watson, 2006 (De hersenen van de rat in stereotaxische Coördinaten, Academic Press). Implantaten zijn beveiligd door tandheelkundig cement. Een bolus van lactaat Ringers van de 0,9% zoutoplossing wordt gegeven aan het eind van de operatie (5mls SC in ratten en 1 ml SC in muizen na vloeistoffen opgewarmd tot een normale lichaamstemperatuur) om uitdroging te voorkomen. Buprenorfine (0.1-0.5mg/kg SC) is tweemaal daags en, vervolgens, op een als een noodzakelijke basis, als het dier lijkt te zijn in pijn. Lokale behandeling met antibiotica (bacitracin zalf) en systemische behandeling met antibiotica (penicilline 100.000 IE / kg IM elke 12 uur gedurende de eerste 48 uur na de operatie) wordt toegediend als post-operatieve infecties optreden.
Na de operatie, zijn dieren individueel gehuisvest met voedsel en water ad libitum beschikbaar. Ten minste een week wordt toegestaan voor het herstel voor microdialyse en euthanasie. Na herstel van een operatie, worden de dieren overgebracht naar een microdialyse kooi en microdialyse sondes worden ingebracht en gecementeerd in de handleiding assen die zijn geïnstalleerd tijdens de operatie. Sonde inbrengen veroorzaakt geen pijn of ongemak omdat de sonde is het omzeilen van de huid, spieren en meningeale weefsel door de gids as. Daarom wordt sonde inbrengen gebeurt zonder verdoving en eventuele anesthesie-geïnduceerde effecten op de Neurochemie of gedrag worden vermeden. Laten we de sondes te stabiliseren gedurende 12 uur en daarna gaan we steekproeven om de 30 minuten nog eens 8-12 uur, afhankelijk van het experiment. Wij monitoren locomotorisch gedrag van het dier door middel van fotocellen of handmatige registratie van beweging door de experimentator. Microdialysate monsters worden geïnjecteerd in een High Performance Liquid Chromatography met elektrochemische detectie (HPLC-EG) instrument voor neurochemische detectie en analyse. We zoeken voor effecten op de basale Neurochemie en bewegingsapparaat gedrag. Aan het eind van het experiment het dier is gedood door een overdosis van de systemische ketamine (200 mg / kg ip) en xylazine (20 mg / kg, ip). Dan wordt het hart geperfuseerd met 0,9% zoutoplossing gevolgd door 4% paraformaldehyde. De hersenen worden verwijderd, bevroren en snijd langs de microdialyse probe-darmkanaal om nauwkeurige sonde plaatsing te verifiëren.
Procedure
- Stel de stereotaxische instrument en alle benodigde materialen. Zorg ervoor dat de ruimte en de instrumenten worden gereinigd en gesteriliseerd.
- Afscheren vacht met elektrisch scheerapparaat. Ga van de oren tot slechts in-tussen de ogen, zet mes in verschillende richtingen om effectief schone omgeving van bont. Van toepassing povidine / jodium aan geschoren gebied, maar beschermen de ogen tegen het.
- Monteer het dier op de stereotaxische apparaat door het plaatsen van het oor bars in de gehoorgang en het aanscherpen van zijn plaats. Monteer eerst een oor bar in de gehoorgang, en dan houd het op zijn plaats en schuif in het andere oor bar. Je weet dat je in de juiste locatie wanneer het hoofd niet meer kan van links naar rechts worden bewogen. Zet de mond met de voorste mount van de stereotaxische en zorg ervoor dat het hoofd is vlak met een liniaal. Doe de heerser in een verticale positie met betrekking tot het stereotaxische instrument platform en controleer of er een hoek van 90 ° tussen de heerser en het midden van de hoofdhuid van het dier). Bevestig dit door de stereotaxische instrument indien het biedt een dergelijke mogelijkheid.
- Maak een anterior / posterior incisie op de hoofdhuid met een steriel scalpel zich uitstrekt van de lambda tot slechts in-tussen de ogen van het dier. Gebruik gesteriliseerd hemostats te knijpen van de huid en de incisie open te houden. Het gebruik van meerdere steriele wattenstaafjes, droog uit de schedel blootgesteld oppervlak.
- Zet de gids canule op zijn berg, vinden bregma op de schedel, en de positie van de gids canule recht over deze locatie. Noteer de voorste / posterior en lateraal coördinaten. Vanaf bregma, vinden de juiste coördinaten die nodig is voor de plaatsing van uw sonde met behulp van de stereotaxische atlas. Plaats de canule gids naar de juiste coördinaten toe te voegen of af te trekken van bregma. Breng uw gids canule omlaag totdat deze is het aanraken van de schedel, en dan noteer dit ventrale coördineren. Maak een potlood markeren met een steriele potlood op deze locatie op de schedel, dit is waar u zult boren.
- Verwijder de gids canule en steriliseren van uw boor. Voorzichtig boren een gat in de potlood teken totdat je door de breedte van de schedel. Neem contact op met de gids canule om te zien of het zou het gat duidelijk zonder het aanraken van de zijkanten. Hou boren en te controleren totdat de canule kan duidelijk in een rechte pad. Zodra het gat is gemaakt, gebruik dan een steriele naald om zachtjes punch de hersenvliezen om onbelemmerde inbrengen van de canule mogelijk te maken.
- Vervolgens met behulp van een handboor, maken zes openingen voor schedel schroeven: twee voorste naar de canule gat, twee lateraal van de canule gat, en twee posterior aan de zijkanten. Steriliseren zes schroeven en leg ze op de schedelbasis uit elkaar totdat ze zijn sterk verankerd op.
- Reinig de gids canule met ethanol en zoutoplossing, mount, en langzaam zakken naar de juiste ventrale coördineren. Zorg ervoor dat de zijkanten niet raken en dat gaat perfect verticaal.
- Plaats het anker schroef mediaal en achter de achterste schedel schroeven en houd deze op zijn plaats met een pincet. Meng een dunne partij van vloeibare tandheelkundige cement en bedek de gids canule, schroeven, en de rest van de schedel met een steriele spatel. Maak een andere partij, dikker deze tijd en volledig bedekken het gebied en de canule en de anker schroef genoeg om het veilig te stellen.
- Als het cement wordt dikker en voordat het stolt, de huid los van de cement-beker en schimmels het cement cup met de spatel om te controleren of het cement dop soepel is overal en niet later de huid irriteren.
- Laat de tandheelkundige cement volledig drogen voordat u het dier uit het apparaat. Verwijder de hemostats. Van toepassing zijn bacitracine helemaal rondom de cement dop.
- Zodra het dier is uit de stereotaxische instrument, te injecteren met 0,25 ml penicilline IM (intra-musculaire), gevolgd door 1 ml van een zoutoplossing SC (subcutaan).
- Plaats het dier in zijn eigen kooi en bewaken totdat het wordt bewust alvorens terug te keren om haar kamer om te herstellen.
- Monitor dieren totdat ze herstellen van narcose op de dag van de operatie en de dagelijkse post-op, tot het einde van het experiment, voor het tekenen van infectie en evaluatie van pijn / verdriet. Dit geldt ook voor het weekend en op feestdagen. Lage spontane beweging, angst vocalisatie op handling, gebogen houding, diarree, zwelling en afvoer in het gebied van de headmount, en het gebrek aan eten / drinken zijn allemaal tekenen van pijn en verdriet. Buprenorfine (0.1-0.5mg/kg SC) is tweemaal daags toegediend, en vervolgens, op een als een noodzakelijke basis, als het dier lijkt te zijn in pijn. Lokale behandeling met antibiotica (bacitracin zalf) en systemische behandeling met antibiotica (penicilline 100.000 IE / kg IM elke 12 uur gedurende de eerste 48 uur na de operatie) wordt toegediend als post-operatieve infecties optreden. Als een van deze symptomen aanhouden na toediening van buprenorfine, aanvullende vloeistof, en een behandeling met antibiotica binnen 12 uur na een operatie, is het dier gedood.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo microdialyse is het middel bij uitstek voor het meten van meerdere neurotransmitters en metabolieten in verschillende plaatsen de hersenen van een levend dier. Echter, het controleert alleen de extracellulaire spiegels van neurotransmitters en het biedt niet de tijd resolutie om neurotransmitter exocytose monitoren in real time. Door middel van een versie van de techniek genaamd "netto-flux", kan de eigenlijke neurotransmitter concentratie op een bepaalde locatie worden berekend, die op hun beurt kunnen nauwkeurige metingen van de snelheid van neurotransmitter heropname geven door middel van plasma membraan transporters.
Microdialyse is ideaal in illustreren verschillen in de basale extracellulaire neurotransmitter niveaus tussen verschillende groepen van dieren (dat wil zeggen verschillende genotypes) en in het ontcijferen van de effecten van drugs of andere bewerkingen op de neurotransmitters.
De introductie van assays alternatief voor de HPLC-EG, zoals capillaire zone elektroforese (CZE) in combinatie met fluorescerende detectie is toegenomen de tijdsresolutie van de in vivo microdialyse binnen een paar minuten per monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ondersteund door DK065872 (ENB), een Smith Family Foundation Award of Excellence in Biomedical Research (ENB), F31 DA023760.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
- Bungay, P. M., Newton-Vinson, P., Isele, W., Garris, P. A., Justice, J. B. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. J. Neurochem. 86, 932-946 (2003).
- Chen, K. C. Effects of tissue trauma on the characteristics of microdialysis zero-net-flux method sampling neurotransmitters. Journal of Theor. Biology. 238, 863-881 (2006).
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N., Creese, I., Hoebel, B. G. Restricted eating with weight loss selectively decreases extracellular dopamine in the nucleus accumbens and alters dopamine response to amphetamine, morphine and food intake. The Journal of Neuroscience. 15, 6640-6650 (1995).
