Summary
O acompanhamento dos níveis de neurotransmissores extracelular em regiões distintas do cérebro de animais que circulam livremente oferece insights sobre a relação entre a liberação do neurotransmissor e comportamento. Em microdiálise in vivo juntamente com detecção eletroquímica fornece anatômicas excelentes e resolução de química; e informações sobre como a neurotransmissão basal é alterada por manipulações farmacológicas ou fisiológicas.
Abstract
A capacidade de medir extracelular níveis basais de neurotransmissores no cérebro de animais acordado permite a determinação dos efeitos de diferentes desafios sistêmicos (farmacológico ou fisiológico) para o SNC. Por exemplo, pode-se medir diretamente como projeções do animal dopamina mesencéfalo responder à dopamina de liberação de drogas como estímulos d-anfetamina ou naturais, como alimentos. Neste vídeo, mostramos-lhe como implante de cânulas guia alvo locais específicos no cérebro de ratos, como inserir e implante de uma sonda de microdiálise e como usar cromatografia líquida de alta eficiência acoplado com detecção eletroquímica (HPLC-CE) para medir os níveis extracelulares de neurotransmissores e metabólitos oxidáveis. Introdução preciso local de medicamentos através da sonda de microdiálise permite para o trabalho refinado da especificidade site em mecanismo de um composto s da ação. Esta técnica tem anatômicas excelentes e resolução de química, mas apenas a resolução de tempo modesto como amostras de microdiálise geralmente são processados a cada 20-30 minutos para garantir níveis de neurotransmissores detectável. Ferramentas complementares ex vivo (ou seja, fatia de cultura de células e eletrofisiologia) pode contribuir para a monitorização em tempo real neurotransmissão.
Protocol
Sumário
Dois meses de idade camundongos C57BL/6J idade média ou equivalente ou três meses de idade média, idade ratos Sprague Dawley ou equivalente são anestesiados com cetamina (60 mg / kg ip para ratos; ip 100 mg / kg para camundongos) e xilazina (10 mg / kg, ip para qualquer espécie). Sedação é monitorado usando uma pitada toe gentil retirar reflexo demonstrado em Walantus et al. (Jove, 6, 2007) e Szot et al. (Jove, 9, 2007). Termorregulação pode ser fornecida através de uma almofada de aquecimento thermostatregulated (ALA Instruments Inc.) e monitoradas através de um termômetro retal. Cabeça é raspada de pele e limpos com iodo antes da incisão. Após a incisão da pele (2 cm de comprimento para ratos, 1 cm de comprimento para ratos) e remoção de todos os tecidos moles da superfície do crânio, a colocação da cânula guia é determinada em relação ao bregma. Um buraco de 6 mm é perfurado através do crânio com um perfurador operado por bateria concebidos para cirurgia de roedores (Ferramentas Ciência Fine, Inc.). Cuidado é tomado para que a broca não penetra através das membranas das meninges ou vasos sanguíneos. Crânio é implantado com bilateral 5 milímetros calibre 21 hastes de aço inoxidável guia que conduz ao núcleo accumbens posterior, striatum dorsal ou córtex pré-frontal. As coordenadas estereotáxica são estabelecidos de acordo com Franklin e Paxinos, 1997 (O Cérebro de rato em Coordenadas estereotáxica, Academic Press) ou Paxinos e Watson, 2006 (O Cérebro de rato em Coordenadas estereotáxica, Academic Press). Os implantes são garantidos por cimento dental. Um bolo de Ringer Lactato da solução salina 0,9% é dado no final da cirurgia (SC 5mls em ratos e 1 ml SC em camundongos após líquidos são aquecidos até a temperatura normal do corpo) para evitar a desidratação. Buprenorfina (0.1-0.5mg/kg SC) é administrado duas vezes ao dia e, então, em uma base como-necessário, se o animal parece estar com dor. Tratamento com antibiótico local (pomada bacitracina) e tratamento com antibióticos sistêmicos (penicilina 100.000 UI / kg IM a cada 12 horas para as primeiras 48 horas pós-op) são administrados se infecções pós-operatórias ocorrem.
Após a cirurgia, os animais são alojados individualmente com alimentos e água ad libitum disponíveis. Pelo menos uma semana é permitido para recuperação antes de microdiálise e da eutanásia. Após recuperação da cirurgia, os animais são transferidos para uma gaiola de microdiálise e sondas de microdiálise são inseridos e cimentado na guia eixos que foram instalados durante a cirurgia. Sonda de inserção não causa dor ou desconforto, porque a sonda está ignorando o tecido muscular, pele e das meninges através do eixo guia. Portanto, a inserção da sonda é feito sem anestesia e os efeitos da anestesia induzida em neuroquímica ou comportamento sejam evitados. Deixamos as sondas estabilizar por 12 horas e, então, iniciar a amostragem a cada 30 minutos para outro 8-12 horas, dependendo do experimento. Nós monitoramos o comportamento locomotor do animal através de fotocélulas ou gravação manual do movimento pelo experimentador. Microdialysate amostras são injetadas em uma Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção Eletroquímica (HPLC-CE) instrumento de detecção e análise neuroquímica. Nós olhamos para os efeitos sobre a neuroquímica basal e comportamento locomotor. No final do experimento o animal é sacrificado por uma overdose de cetamina sistêmica (200 mg / kg ip) e xilazina (20 mg / kg, ip). Então o coração é perfundido com solução salina a 0,9%, seguido por paraformaldeído a 4%. Os cérebros são removidos, congelados e cortados ao longo do trato sonda de microdiálise para verificar colocação da sonda precisa.
Procedimento
- Configurar o aparelho estereotáxico e todos os materiais necessários. Verifique se a área e os instrumentos são limpos e esterilizados.
- Raspar a pele com barbeador elétrico. Vão desde os ouvidos apenas em entre os olhos, passar a navalha em diferentes direções para efetivamente limpar a área de pele. Aplicar povidine / iodo para a área raspada, mas proteger os olhos dela.
- Montar o animal no aparelho estereotáxico, colocando as barras de ouvido dentro do canal auditivo e aperto no lugar. Primeira montagem de barra de um ouvido no canal do ouvido, e depois mantê-lo no lugar e deslize na barra de outra orelha. Você sabe que está no local correto quando a cabeça não pode mais ser movido para os lados. Assegurar a boca com a montagem anterior do estereotáxica e certifique-se que a cabeça está nivelada com uma régua. Coloque a régua na posição vertical em relação à plataforma de instrumento estereotáxico e verificar se há um ângulo de 90 ° entre o governante eo meio do couro cabeludo do animal). Confirmar isso através do instrumento estereotáxico se oferece tal capacidade.
- Faça uma incisão anterior / posterior do couro cabeludo com um bisturi estéril que se estende do lambda apenas no meio dos olhos do animal. Use hemostats esterilizados para beliscar fora da pele e manter a incisão aberta. Usando vários cotonetes estéreis, secar a superfície do crânio exposto.
- Colocar a cânula guia para sua montagem, encontrar bregma no crânio, e posicionar a guia direita cânula esse local. Anote as coordenadas anterior / posterior e lateral. De bregma, encontrar as coordenadas necessárias para corrigir o posicionamento do seu teste com o auxílio do atlas estereotáxico. Posição da cânula guia para as coordenadas corretas, adicionando ou subtraindo bregma. Traga a sua cânula guia para baixo até que ele está tocando o crânio, e depois gravar essa coordenada ventral. Faça uma marca de lápis com um lápis estéril neste local no crânio, que é onde você será perfuração.
- Remova a cânula guia e esterilizar sua broca. Cuidadosamente furar um buraco na marca do lápis até chegar através da largura do crânio. Verifique com a cânula guia para ver se ele iria limpar o buraco sem tocar os lados. Mantenha perfuração e verificar até que a cânula pode limpar num caminho reto. Uma vez que o buraco é feito, use uma agulha estéril para perfurar o delicadamente meninges, a fim de permitir a inserção desobstruída da cânula.
- Em seguida, usando uma broca de mão, faça seis furos para parafusos de cabeça: dois para o buraco anterior cânula, dois laterais para o buraco cânula, posterior e dois para os lados. Esterilizar seis parafusos e colocá-los sobre o crânio até que sejam firmemente ancoradas em.
- Limpar a cânula guia com etanol e soro fisiológico, montar e abaixá-lo lentamente para a coordenada adequada ventral. Certifique-se que os lados não estão tocando e que está indo perfeitamente vertical.
- Coloque o parafuso âncora medialmente e atrás os parafusos posterior do crânio e segurá-la no lugar com uma pinça. Misture um lote fina de cimento dental líquido ea tampa da cânula guia, parafusos, eo resto do crânio com uma espátula estéril. Fazer outro lote, desta vez mais grosso, e cobrir completamente a área eo parafuso cânula e ancorar o suficiente para prendê-lo.
- Como o cimento se torna mais espessa e antes que ele se solidifica, separar a pele da taça de cimento e molde o copo de cimento com a espátula para assegurar que a tampa de cimento é suave ao redor e não irritar a pele mais tarde.
- Permitir que o cimento dental para secar completamente antes de remover o animal do aparelho. Remover o hemostats. Aplicar bacitracina a toda a volta a tampa de cimento.
- Uma vez que o animal está fora do instrumento estereotáxico, injetá-lo com 0,25 ml de penicilina IM (intra-muscular), seguido de 1 ml de solução salina SC (subcutânea).
- Coloque o animal em sua própria gaiola e monitorá-lo até que se torne consciente antes de devolvê-lo ao seu quarto para se recuperar.
- Acompanhar os animais até que eles se recuperar da anestesia sobre o dia da cirurgia e diariamente no pós-operatório, até o final do experimento, os sinais de infecção e avaliação da dor / sofrimento. Isto inclui fins de semana e feriados. Movimento espontâneo de baixa, vocalização angústia sobre manuseio, postura arqueada, diarréia, inchaço e descarga na área da Headmount, e falta de alimentação / beber são todos os sinais de dor e angústia. Buprenorfina (0.1-0.5mg/kg SC) é administrado duas vezes ao dia, e depois, em uma base como-necessário, se o animal parece estar com dor. Tratamento com antibiótico local (pomada bacitracina) e tratamento com antibióticos sistêmicos (penicilina 100.000 UI / kg IM a cada 12 horas para as primeiras 48 horas pós-op) são administrados se infecções pós-operatórias ocorrem. Se algum destes sintomas persistirem após a administração de buprenorfina, fluido suplementar, e tratamento com antibióticos nas primeiras 12 horas de cirurgia, o animal é sacrificado.
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Discussion
Em microdiálise in vivo é a ferramenta de escolha para medir vários neurotransmissores e metabólitos em locais distintos do cérebro de um animal vivo. No entanto, ele só monitora os níveis extracelulares de substâncias neuroquímicas e não oferece a resolução de tempo para monitorar exocitose do neurotransmissor em tempo real. Através de uma versão da técnica chamada de "net-flux", a concentração do neurotransmissor real em um determinado site pode ser calculado, que por sua vez pode dar medições precisas da taxa de recaptação de neurotransmissores através de transportadores de membrana plasmática.
Microdiálise é ideal para ilustrar as diferenças de níveis basais de neurotransmissor extracelular entre os diferentes grupos de animais (ou seja, diferentes genótipos) e em decifrar os efeitos de drogas ou outras manipulações na liberação do neurotransmissor.
A introdução de ensaios alternativa para HPLC-CE, como eletroforese capilar de zona (CZE) acoplado com detecção fluorescente aumentou o tempo de resolução de microdiálise in vivo em poucos minutos por amostra.
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Acknowledgments
Apoiada por DK065872 (PEV), uma Smith Award Foundation Família de Excelência em Pesquisa Biomédica (PEV), F31 DA023760.
Materials
| Materials are described in the protocol document. |
References
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