La cirugía estereotáxica de supervivencia en los roedores

Summary

El seguimiento de los niveles de neurotransmisores extracelular en las regiones cerebrales distintas de animales libres de movimiento además de informaciones sobre el vínculo entre la liberación de neurotransmisores y la conducta. Microdiálisis in vivo, junto con detección electroquímica ofrece anatómica excelente y la resolución de químicos, así como información sobre cómo la neurotransmisión basal se ve alterada por las manipulaciones farmacológicas o fisiológicas.

Abstract

La capacidad de medir los niveles extracelulares basales de los neurotransmisores en el cerebro de los animales despiertos permite la determinación de los efectos de los diferentes retos sistémicos (farmacológica o fisiológica) para el sistema nervioso central. Por ejemplo, uno puede medir directamente cómo las proyecciones de la dopamina del cerebro medio animal responde a la dopamina-la liberación de fármacos, como los estímulos d-anfetamina o naturales como la comida. En este video, te mostramos cómo implantar cánulas guía de orientación sitios específicos en el cerebro de la rata, la forma de insertar e implantar una sonda de microdiálisis y el uso de cromatografía líquida de alto rendimiento, junto con detección electroquímica (HPLC-CE) para medir los niveles extracelulares de oxidables neurotransmisores y metabolitos. Introducción Local precisa de fármacos a través de la sonda de microdiálisis permite un trabajo refinado en la especificidad del sitio en el mecanismo de un compuesto s de la acción. Esta técnica ha anatómica excelente y la resolución de química, pero sólo el tiempo de resolución modesta como muestras de microdiálisis se procesan cada 20-30 minutos para asegurar niveles detectables de neurotransmisores. Complementarias ex herramientas vivo (es decir, cortar y de cultivo celular, electrofisiología) puede ayudar con la monitorización en tiempo real de la neurotransmisión.

Protocol

Resumen

Dos meses de edad, los ratones C57BL/6J edad media o equivalente o tres meses de edad promedio de edad de las ratas Sprague Dawley o equivalente son anestesiados con ketamina (60 mg / kg ip para las ratas, 100 mg / kg ip de ratones) y xilazina (10 mg / kg, ip, ya sea para las especies). La sedación se controla mediante una pizca punta suave reflejo de retirar demostrado en Walantus et al. (JOVE, 6, 2007) y Szot et al. (JOVE, 9, 2007). Termorregulación puede ser proporcionada a través de una almohadilla eléctrica thermostatregulated (ALA Instruments Inc.) y monitoreados a través de un termómetro rectal. La cabeza rapada de pelo y limpiar con yodo antes de la incisión. Después de incisión en la piel (2 cm de largo para las ratas, 1 cm de largo para los ratones) y la eliminación de todos los tejidos blandos de la superficie del cráneo, la colocación de la cánula guía se determina en relación a bregma. Un agujero de 6 mm se perfora el cráneo con un taladro a pilas para cirugía de roedores (Herramientas de Bellas Science, Inc.). Hay que tener cuidado para que la broca no penetra a través de las membranas meníngeas o los vasos sanguíneos. Skull se implanta con bilaterales de 5 mm calibre 21 ejes de acero inoxidable guía que conduce al núcleo accumbens posterior, el cuerpo estriado dorsal o la corteza prefrontal. Las coordenadas estereotáxicas se establecen de acuerdo con Franklin y Paxinos, 1997 (el cerebro del ratón en coordenadas estereotáxica, Academic Press) o Paxinos y Watson, 2006 (el cerebro de rata en coordenadas estereotáxica, Academic Press). Los implantes se fijan con cemento dental. Un bolo de Ringer lactato de la solución salina al 0,9% se da al final de la cirugía (5ml SC en ratas y 1 ml SC en ratones después de los fluidos se calientan a la temperatura normal del cuerpo) para prevenir la deshidratación. La buprenorfina (0.1-0.5mg/kg SC) se administra dos veces al día y, luego, en una función de las necesidades, si el animal parece estar en el dolor. El tratamiento local con antibióticos (bacitracina pomada) y el tratamiento con antibióticos sistémicos (penicilina 100.000 UI / kg IM cada 12 horas durante las primeras 48 horas después de la operación) si se administran después de la operación las infecciones.

Después de la cirugía, los animales son alojados individualmente con comida y agua ad libitum disponibles. Al menos una semana se permite para la recuperación antes de microdiálisis y la eutanasia. Tras la recuperación de la cirugía, los animales son trasladados a una jaula de microdiálisis y sondas de microdiálisis se insertan y se consolidó en los ejes de guía que se han instalado durante la cirugía. Sonda de inserción no causa dolor o malestar debido a que la sonda está pasando por alto tejido de la piel, los músculos y las meninges a través del eje de guía. Por lo tanto, la inserción de la sonda se realiza sin anestesia y los efectos de anestesia inducida por el comportamiento de la neuroquímica o se evitan. Dejamos que las sondas de estabilizar durante 12 horas y luego iniciar el muestreo cada 30 minutos por otro 12.08 horas, dependiendo del experimento. Hacemos un seguimiento de comportamiento locomotor del animal a través de fotocélulas o registro manual de movimiento por el experimentador. Microdialysate muestras se inyectan en una cromatografía líquida de alta con detección electroquímica (HPLC-CE), instrumento para la detección y análisis neuroquímico. Buscamos efectos sobre la neuroquímica basal y el comportamiento del aparato locomotor. Al final del experimento, el animal es sacrificado por una sobredosis de ketamina sistémica (200 mg / kg ip) y xilazina (20 mg / kg, ip). Entonces, el corazón es perfundido con solución salina al 0,9% seguido de paraformaldehído al 4%. Los cerebros se retiran, congeladas y cortadas a lo largo de las vías de la sonda de microdiálisis para verificar la colocación de la sonda precisa.

Procedimiento

1. Coloque el instrumento estereotáxico y todos los materiales necesarios. Asegúrese de que el área y los instrumentos se limpian y se esterilizan.
   
   
2. Afeitarse la piel con maquinilla de afeitar eléctrica. Van desde las orejas hasta justo entre los ojos, mover de afeitar en diferentes direcciones para limpiar con eficacia la zona de la piel. Aplicar povidona / yodo a la zona de afeitado, sino proteger los ojos de ella.
   
   
3. Montar el animal en el aparato estereotáxico mediante la colocación de las barras de oído en el conducto auditivo externo y el ajuste en su lugar. En primer lugar montar un bar de oído en el conducto auditivo externo, y luego mantenerlo en su lugar y se deslizan en la barra de la otra oreja. Usted sabe que está en la ubicación correcta cuando la cabeza ya no puede ser movido de lado a lado. Asegurar la boca con el montaje anterior de la estereotáxica y asegúrese de que la cabeza esté a nivel con una regla. Coloque la regla en posición vertical con respecto a la plataforma del instrumento estereotáxico y comprobar si hay un ángulo de 90 ° entre el gobernante y el centro de la cabeza del animal). Confirmarlo mediante el instrumento estereotáxico si ofrece esa capacidad.
   
   
4. Hacer una incisión anterior / posterior en el cuero cabelludo con un bisturí estéril que se extiende desde la lambda para justo entre los ojos del animal. Use pinzas hemostáticas esterilizados para desprender la piel y mantener la incisión abierta. El uso de varios hisopos de algodón estériles, secar la superficie del cráneo al descubierto.
   
   
5. Coloque la cánula guía en su montura, encontrar bregma en el cráneo, y la posición del derecho cánula guía en este lugar. Anote las coordenadas anterior / posterior y lateral. Desde bregma, encontrar las coordenadas correctas necesarias para la colocación de la sonda con la ayuda del atlas estereotáxico. La posición de la cánula guía para las coordenadas correctas, añadiendo o restando de bregma. Traiga su cánula guía hacia abajo hasta que toque el cráneo, y luego grabar esta coordenada ventral. Haga una marca de lápiz con un lápiz estéril en este lugar en el cráneo, que es donde se le de perforación.
   
   
6. Retire la cánula guía y esterilizar su broca. Con cuidado, perfore un agujero en la marca del lápiz hasta llegar a través de la anchura del cráneo. Consulte con la cánula guía para ver si podía limpiar el agujero sin tocar los lados. Mantenga la perforación y el control hasta que la cánula puede borrar en un camino recto. Una vez que se hace el agujero, use una aguja estéril para golpear suavemente las meninges con el fin de permitir la inserción de la cánula sin obstrucciones.
   
   
7. A continuación, utilizando un taladro de mano, hacer seis agujeros para tornillos de cabeza: dos por delante del orificio de la cánula, dos laterales para el agujero de la cánula, y posterior a los lados dos. Esterilizar seis tornillos y colocarlos en el cráneo hasta que estén bien anclados en.
   
   
8. Limpie la cánula guía con etanol y la solución salina, montar y bajar lentamente a la coordenada correcta ventral. Asegúrese de que los lados no se toquen y que va a la perfección vertical.
   
   
9. Coloque el tornillo de anclaje medial y detrás de los tornillos de cabeza posterior y mantenerla en su lugar con unas pinzas. Mezcle un lote delgada de cemento dental líquido y cubrir la cánula guía, tornillos, y el resto del cráneo con una espátula estéril. Hacer otro lote, esta vez más grueso, y cubren por completo la zona y el tornillo de la cánula y el anclaje suficiente para asegurarla.
   
   
10. A medida que el cemento se vuelve más grueso y antes de que solidifique, separar la piel de la Copa del cemento y el molde de la copa de cemento con la espátula para asegurarse de que la tapa de cemento es lisa por todas partes y no irrita la piel después.
    
    
11. Deje que el cemento dental se seque por completo antes de retirar al animal del aparato. Retire la hemostatos. Aplique bacitracina todo el camino alrededor de la tapa de cemento.
    
    
12. Una vez que el animal está fuera del instrumento estereotáxico, que se inyectan con 0,25 ml de penicilina IM (intramuscular), seguido de 1 ml de solución salina SC (subcutánea).
    
    
13. Colocar el animal en su propia jaula y el monitor hasta que se tome conciencia antes de volver a su habitación para recuperarse.
    
    
14. Observar a los animales hasta que se recupere de la anestesia en el día de la cirugía y al día después de la operación, hasta el final del experimento, los signos de infección y la evaluación del dolor / angustia. Esto incluye los fines de semana y días festivos. Escaso movimiento espontáneo, la vocalización de socorro durante la manipulación, postura encorvada, diarrea, hinchazón y pus en el área de la headmount, y la falta de alimentación / consumo, son signos de dolor y angustia. La buprenorfina (0.1-0.5mg/kg SC) se administra dos veces al día, y luego, en una función de las necesidades, si el animal parece estar en el dolor. El tratamiento local con antibióticos (bacitracina pomada) y el tratamiento con antibióticos sistémicos (penicilina 100.000 UI / kg IM cada 12 horas durante las primeras 48 horas después de la operación) si se administran después de la operación las infecciones. Si alguno de estos síntomas persisten después de la administración de buprenorfina, el líquido adicional, y el tratamiento antibiótico en las 12 horas de cirugía, el animal es sacrificado.

Discussion

Microdiálisis in vivo es la herramienta de elección para la medición de múltiples neurotransmisores y metabolitos en sitios distintos del cerebro de un animal vivo. Sin embargo, sólo controla los niveles extracelulares de neurotransmisores y que no ofrece el tiempo de resolución de monitor de exocitosis de neurotransmisores en tiempo real. A través de una versión de la técnica llamada "red de flujo", la concentración de neurotransmisores real en un lugar determinado se puede calcular, que a su vez puede dar las medidas exactas de la frecuencia de la recaptación de los neurotransmisores a través de transportadores de membrana plasmática.

Microdiálisis es ideal para ilustrar las diferencias en los niveles basales de neurotransmisor extracelular entre los diferentes grupos de animales (es decir, diferentes genotipos) y en el desciframiento de los efectos de las drogas u otras manipulaciones en la liberación de neurotransmisores.

La introducción de ensayos alternativos para HPLC-CE, como la electroforesis capilar de zona (CZE), junto con detección fluorescente se ha incrementado el tiempo de resolución de microdiálisis in vivo en pocos minutos por muestra.

Materials

Materials are described in the protocol document.