Summary
해부 및 개별 뇌 영역에서 세포의 성장은 세포와 생리적 매개 변수의 조사를 용이하게합니다. 우리는 혈청이없는 환경에서 신경 세포 - 풍부한 문화를 생산하는 주요 세포 culturing에 대한 방법을 설명합니다.
Abstract
hippocampal 신경의 생리적 특성은 일반적으로 특히 때문에 학습 및 메모리에 해마의 참여의 조사입니다. 기본 hippocampal 세포 culturing은 neuroscientists는 개별 세포와 단일 버렸네 수준에서 뉴런의 활동과 속성을 확인하실 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 신생아 쥐의 기본 hippocampal 세포를 분리하고 성장하는 방법을 보여줍니다. 해마는 2~3분만큼 짧은 각 신생아 동물로부터 격리 수 있으며, 문화 두 주에 유지하실 수 있습니다. 우리는 또한 간략하게 ratiometric 칼슘 이미징 이러한 hippocampal 뉴런을 사용하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 이 프로토콜은 어떠한 수정을 거의, 해마에 대한 과정을 설명하는 동안, 그것은 두뇌의 다른 지역에 적용할 수 있습니다.
Protocol
hippocampal 분리하기 전에
hippocampal 고립을 시작하기 전에 모든 도구 멸균되어 있는지 확인합니다. 70 % 에탄올과 문화 후드를 스프레이하고, 후드 내부의 도구를 놓으십시오. , 멸균 폴리 - L 코팅 유리 coverslips, pipettors 및 팁, 일회용 pipettes, 그리고 전기 pipettor과 10 cm 배양 접시 - 당신이 6 필요합니다. 이 시점부터는 올바른 살균 기술을 사용해야합니다.
- 물 목욕 켜고 그것이 37 ° C.까지 가열되어 있는지 확인합니다
- 4 저장되어있는 다음과 같은 솔루션 ° C가 필요합니다 :
- 수정된 이글의 중간 (멤)
- Neurobasal
- 행크의 버퍼 생리 식염수 (HBSS)
- Borate 버퍼 솔루션
- 나트륨 pyruvate 솔루션
- 증류수에 멸균 필터링 20 % 포도당 용액
- 후드에서 그들을 배치하기 전에 70 %의 에탄올과 함께 모든 병을을 스프레이하십시오.
- 냉동실에서 이러한 냉동 솔루션을 가지고 온수 물 목욕에서 그들을 장소 :
- 말 혈청 5 ML의 나누어지는
- B - 27 보충의 한 ML의 나누어지는
- 100X 항생제의 한 ML의 나누어지는 (페니실린 스트렙토 마이신 플러스)
- L - 글루타민 및 0.5 ML의 나누어지는
- 솔루션은 해동 후, 물 목욕 그들을 데리고 70 % 에탄올과 그들을 스프레이하고, 후드에서 그들을 놓으십시오. 이제 도금과 Neurobasal 매체 준비하실 수 있습니다.
- 해결책이 준비 후 hippocampal 고립을 수행하는 동안 워밍업을 단단히 용기 뚜껑과 37 ° C 목욕에서 그들을 놓으십시오.
- 또한, 냉장고 밖으로 프로 테아제 트립신 (2.5 %)의 나누어지는를 타고 물 욕조에 넣습니다. 트립신은 다음 단계에서 격리됩니다 해부하는 해마를 소화합니다.
- , 15ml 원뿔 튜브를 타고 HBSS로 기입하고, 치료 그룹으로 분류. 그것은 고립된 hippocampi는 다음 단계에서 수집됩니다 여기에 있습니다.
Hippocampal 절연
- hippocampal 격리를 시작하려면 신생아 새끼는 깨끗해하고 우유 밴드, placentas, 그들의 어머니에 의해 제거 탯줄 코드를 적이 있는지 확인하십시오.
- 청소하고, 후드에서 그들을 곳으로 70 %의 에탄올과 배양 접시에있는 스프레이 새끼를 놓습니다. 동물은 euthanized culturing 바로 앞에 있습니다.
- 자세한 살균 한 접시에서 강아지를 타고 70 % 에탄올로 강아지를 찍어 다음 멸균 HBSS 두 씻는다로.
- 가위로 시체에서 머리를 제거합니다. 같은 가위를 사용하여 피부와 두개골을 통해 했네요.
- 멀리 두뇌에서 두개골 껍질, 괜찮아요 족집게 한 켤레를 사용하여 멸균 HBSS의 작은 금액을 포함하는 작은 페트리 접시에 머리를 놓으십시오.
- 대뇌 반구 다시 필. 해마는 중간 측두엽에있는 작은 해마 모양의 구조입니다.
- 15 ML 튜브의 HBSS 3 ML에 해마과 장소를 제거합니다. 각각의 강아지와 함께 이러한 단계를 반복하고, 15 ML 튜브에 각각 분리된 해마를 놓으십시오. 이제 하나의 세포로 조직을 떼어 놓다 시간이 있습니다.
Hippocampal 세포 분리
- 모든 hippocampi가 고립되어 후 HBSS와 4.5 ML로 15 ML 튜브를 입력하십시오.
- 후드에있는 물 목욕, 에탄올과 스프레이, 장소에서 트립신을 제거합니다. 튜브에 트립신 0.5 ML를 추가하고 37 15 분 동안 품어 ° C.
- 후드에서 튜브의 바닥에 정착 hippocampi을 방해하지 않도록주의하고, 멸균 피펫으로 튜브에서 HBSS / 트립신 용액을 제거합니다. 부드럽게 관과 소용돌이에 HBSS 5 ML을 추가합니다. ° C 5 분 37 알을 품다.
- 이전 HBSS를 제거하고 신선한 솔루션으로 대체 두번이 단계를 반복합니다.
- 냉동고의 I가 DNAse의 나누어지는 가져가라. 4.5 ML의 HBSS에 hippocampi에 DNase 0.5 ML를 추가합니다. DNAse는 효소 불활 성화를 촉진에 추가됩니다.
- 솔루션을 씹다 (또는 그리고 아래로 피펫)는 동질 때까지. homogenate에 거품을 소개하지 않도록주의하십시오.
- trypan 블루 제외 메서드를 사용하여 세포 생존을 확인합니다.
- 6-8 coverslips을 포함 10cm 페트리 접시를 타고, 도금 매체 10 ML를 추가합니다. coverslips 들어있는 접시에 세포의 원하는 번호를 피펫. 소용돌이는 부드럽게 세포를 분산하고, coverslips가 중복되지 않도록합니다.
- 세포 5 % CO 2 humidified 37 ° C 배양기에서 2-4시간 위해 첨부할 수 있습니다. 세포가 가능한되며 첨부 것을 확인한 후, Neurobasal 매체를 포함하는 각각의 요리에 coverslips을 전송하기만하면됩니다. 인큐베이터에 다시 이런 요리를 놓습니다.
- 일주일에 한 번, 필요한만큼, 신선한 Neurobasal 매체와 실험 치료와 매체의 3 분의 1을 교체하십시오. 이제 문화에서 이러한 세포의 기능 특성 연구로 준비가되어 있습니다.
Hippocampal 뉴런의 Fura - 2 칼슘 이미징
- 교양 hippocampal 뉴런 48 시간 (하지만 이전)에 대한 체외에 있었 후, 칼슘 이미징 실험을 시작할 수 있습니다. 이 시점에서,이 뉴런들은 프로세스를 확장하기 시작한다. 칼슘 이미징을위한 최적의 연령 범위는 체외 3 일에서 7입니다.
- Fura - 2와 부하 문화 37 30 분 AM ° 그들이 어떤 샘플 매 150ms를 칼슘 표시기 염료 및 512 비트 CCD 카메라를 자극하는 제논 아크 램프를 사용하여 20X 목적에 따라 몇 군데 수있는 후에 C.
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Discussion
이 프로토콜은 게리 뱅커와 김 고슬린 1의 혁신적인 작품의 수정으로 개발되었습니다. 이 책은 culturing 세포에 관심이 사람을위한 필수적인 리소스입니다 -뿐만 아니라 신경 세포 - 풍부한 문화는 현재 프로토콜 설명했다.
세포 culturing에있는 세 개의 가장 중요한 요소는 다음과 같습니다 불임, 속도, 사용되는 매체의 선택이다.
불임 - 층류 / 살균 후드, 무균 조건 및 무균 인큐베이터가 필요합니다. 모든 단계에서 오염뿐만 아니라 당신이 작업하고있는 현재의 실험뿐만 아니라, 계획되었을 수도 후속 작업 해로운 것입니다. 인큐베이터가 오염 된 후에, 그것이 세척 및 멸균하려면 주 (또는 달)이 걸릴 수 있습니다. 오염이 눈에 띄는 수준에서 즉시 분명 없지만, 확실히 세포 생존과 세포 생리학에 영향을 미칠 것입니다. 불임은 필수적입니다.
속도 - 교양 세포의 건강은 강력하게 세포의 분위기와 미디어 환경을 통제할 수없는 시간의 금액에 묶여있다. 따라서, 그것은 세포 도금 매체에까지 동물의 세포를 제거하는 데 필요한 시간의 양이 최소한 것을 중요합니다. 수많은 단계 (트립신의 잠복기 또는 세차되고 시간) 변경될 수 없기 때문에, 어떻게 변경할 수 있습니다하면 두뇌의 세포를 제거하는 데 필요한 시간의 금액입니다. 자주 절개를 연습합니다. 이 단계에 필요한 시간의 양은 다시 재현할 수 있어야합니다.
매체의 선택 - 수많은 독점적인 매체의 하나가있다는 Neurobasal입니다. Neurobasal, glial 시설 매체 사용의 일 이전에 (별도 만들 필요 - 이것은 뱅커와 고슬린 1 책에서 설명하는 것은)가 필요했습니다. 상관없이, 당신이 사용중인 매체에 뭔지는 알고하는 것이 중요합니다. Neurobasal 등 B - 27와 같은 보완과 함께 자주 사용됩니다. 그들은 세포의 속성에 영향을 미칠 수있는 이러한 매체 및 보조제의 성분은, 알려진되었는지 확인합니다. 그것은 스테로이드 호르몬 (내 연구실에서 수행한 작업의 큰 부분은 스테로이드 호르몬의 행동을 조사 것을 주어) 피하기 위해 혈청 무료 / 숯불 송두리째 / 페놀 레드 무료로 매체를 사용하여 내 연구실에서 표준 방법입니다. 이 개념은 - 당신이 사용하고있는 솔루션이 뭔지 알아요 - 셀 culturing의 모든 단계에 중요합니다.
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Acknowledgments
JLN는 MH 68347에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
