Summary
La dissection et la croissance de cellules provenant d'une zone du cerveau individuel facilite enquête sur les paramètres cellulaires et physiologiques. Nous décrivons un procédé de culture de cellules primaires qui produit des cultures enrichies en neurones dans un environnement dépourvu de sérum.
Abstract
Les propriétés physiologiques des neurones de l'hippocampe sont couramment étudiés, notamment en raison de l'implication de l'hippocampe dans l'apprentissage et la mémoire. Primaire culture cellulaire hippocampique permet neuroscientifiques d'examiner l'activité et les propriétés des neurones à la cellule individuelle et le niveau de la synapse unique. Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler et de cultiver des cellules primaires d'hippocampe de rats nouveau-nés. L'hippocampe peut être isolée de chaque animal nouveau-né dans le plus court de 2 à 3 minutes, et les cultures peuvent être maintenus pendant jusqu'à deux semaines. Nous allons aussi brièvement démontrer comment l'utilisation de ces neurones de l'hippocampe pour l'imagerie calcique ratiométrique. Alors que ce protocole décrit le processus de l'hippocampe, avec peu ou aucune modification, il peut être appliqué à d'autres régions du cerveau.
Protocol
Avant l'isolement hippocampique
Avant le début de l'isolement de l'hippocampe, assurez-vous que tous les outils sont stériles. Vaporiser le bas de la hotte de la culture à l'éthanol 70%, et place les outils à l'intérieur du capot. Vous aurez besoin de 6 - et 10-cm boîtes de Pétri, stérile poly-L lamelles de verre enduit, pipettes et des conseils, des pipettes jetables, et une pipette électrique. A partir de ce moment, pensez à utiliser une technique stérile correcte.
- Mettez le bain d'eau et assurez-vous qu'il est chauffé à 37 ° C.
- Les solutions suivantes qui sont conservés à 4 ° C seront nécessaires:
- Eagle modifié Medium (MEM)
- Neurobasal
- Hank solution saline tamponnée (HBSS)
- Solution tampon borate
- Solution de pyruvate de sodium
- Filtration stérile solution de glucose à 20% dans l'eau distillée
- Assurez-vous de pulvériser toutes les bouteilles vers le bas avec 70% d'éthanol avant de les placer dans la hotte.
- Prenez ces solutions congelées du congélateur et les placer dans un bain d'eau chauffée:
- Une partie aliquote de 5 ml de sérum de cheval
- Une partie aliquote de 1 ml de B-27 complètent
- Une partie aliquote de 1 ml de 100X antibiotiques (pénicilline plus streptomycine)
- Et une partie aliquote 0,5 ml de L-glutamine
- Après les solutions sont décongelés, les sortir du bain d'eau, les arroser avec de l'éthanol à 70%, et les placer dans la hotte. Maintenant, le support de placage et Neurobasal peuvent être préparés.
- Après les solutions sont préparées, le bonnet d'contenants hermétiquement et placez-les dans le bain à 37 ° C pour se réchauffer tout en effectuant l'isolement hippocampe.
- En outre, prélever une aliquote de la trypsine protéase (2,5%) hors du congélateur et le placer dans l'eau du bain. La trypsine va digérer l'hippocampe disséqué, qui sera isolé dans l'étape suivante.
- Prenez un tube de 15ml conique, le remplir avec du HBSS, et c'est l'étiquette avec le groupe de traitement. C'est ici que hippocampes isolées seront recueillies à l'étape suivante.
Isolement hippocampe
- Pour commencer l'isolement de l'hippocampe, assurez-vous que les nouveau-nés sont propres et ont eu leurs bandes de lait, les placentas et cordons ombilicaux enlevés par leur mère.
- Placez les chiots dans une boîte de Pétri, de pulvérisation avec de l'éthanol à 70% pour nettoyer, et les placer dans la hotte. Les animaux sont euthanasiés immédiatement avant la culture.
- Pour la stérilisation en outre, prendre un chiot de l'antenne, tremper le chiot en éthanol de 70%, puis en deux lavages de HBSS stérile.
- Retirez la tête du corps avec des ciseaux. En utilisant les ciseaux même, couper à travers la peau et le crâne.
- En utilisant une paire de pinces fines, pelez le crâne loin du cerveau et la place du cerveau dans une petite boîte de Petri contenant une petite quantité de HBSS stérile.
- Peler les hémisphères cérébraux. L'hippocampe est une petite structure en forme d'hippocampe-dans le lobe temporal médial.
- Retirez l'hippocampe et le lieu dans 3 ml de HBSS dans un tube de 15 ml. Répétez ces étapes avec chaque chiot, et placer chaque hippocampe isolés dans le tube de 15 ml. Maintenant, il est temps de dissocier le tissu à des cellules individuelles.
Cellules hippocampiques de dissociation
- Après tout hippocampes ont été isolés, remplir le tube de 15 ml à 4,5 ml avec HBSS.
- Retirez la trypsine du bain d'eau, pulvérisation avec de l'éthanol, et sa place dans le capot. Ajouter 0,5 ml de trypsine dans le tube et incuber pendant 15 minutes à 37 ° C.
- Dans la hotte, enlever la solution HBSS / trypsine du tube avec une pipette stérile, en prenant soin de ne pas déranger les hippocampes qui se sont installés au fond du tube. Ajouter 5 ml de HBSS dans le tube et agiter doucement. Incuber à 37 ° C pendant 5 minutes.
- Répétez cette étape deux fois, en supprimant l'ancienne HBSS et les remplacer par une solution fraîche.
- Prenez une aliquote de DNAse I du congélateur. Ajouter 0,5 ml de DNase à l'hippocampe en 4,5 ml de HBSS. La DNase est ajoutée afin de promouvoir l'inactivation des enzymes.
- Triturer la solution (ou une pipette haut et bas) jusqu'à ce qu'elle soit homogène. Soyez prudent de ne pas introduire des bulles dans l'homogénat.
- Déterminer la viabilité des cellules avec la méthode exclusion du bleu trypan.
- Prenez une boîte de Petri de 10 cm contenant 6 à 8 lamelles, et ajouter 10 ml de milieu de placage. Pipeter le nombre souhaité de cellules de la boîte contenant les lamelles. Agiter doucement pour disperser les cellules, et assurez-vous que les lamelles ne se chevauchent pas.
- Laisser les cellules se fixer pendant 2-4 heures dans un incubateur humidifié 37 ° C avec 5% de CO 2. Après avoir vérifié que les cellules sont viables et ont fixé, le transfert des lamelles aux plats individuels contenant milieu Neurobasal. Placer ces plats de retour dans l'incubateur.
- Une fois par semaine, remplacez un tiers de la moyenne avec milieu Neurobasal frais et des traitements expérimentaux, au besoin. Maintenant, les propriétés fonctionnelles de ces cellules en culture sont prêts à être étudiés.
Fura-2 d'imagerie calcique des neurones de l'hippocampe
- Après des cultures de neurones hippocampiques ont été in vitro pendant 48 heures (mais pas plus tôt), des expériences d'imagerie calcique peut commencer. À ce stade, ces neurones doivent avoir commencé à étendre les processus. La tranche d'âge optimal pour l'imagerie du calcium est de jour in vitro de 3 à 7.
- Cultures de charge avec Fura-2 heures 30 minutes à 37 ° C, après quoi ils peuvent être visualisés sous un objectif 20X en utilisant une lampe à arc Xenon pour exciter le colorant indicateur de calcium et d'une caméra CCD de 512 bits, qui tous les échantillons 150ms.
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Discussion
Ce protocole a été développé comme une modification de l'œuvre séminale de Gary Banquier et Kim Goslin 1. Ce livre est une ressource essentielle pour quiconque s'intéresse à la culture de cellules - non seulement les cultures de neurones enrichi décrites dans le protocole actuel.
Les trois facteurs les plus critiques dans la culture cellulaire sont: la stérilité, la vitesse, le choix du support utilisé.
Stérilité - un écoulement laminaire / hotte stérile, des conditions d'asepsie, et un incubateur de stériles sont nécessaires. Contamination à n'importe quelle étape est préjudiciable non seulement à l'expérience actuelle sur lequel vous travaillez, mais aussi les travaux ultérieurs qui peuvent avoir été planifiées. Après un incubateur devient contaminé, il peut prendre des semaines (ou un mois) pour le faire nettoyer et stérile. La contamination, tout en n'étant pas immédiatement évident au niveau visible, va certainement affecter la viabilité cellulaire et physiologie cellulaire. La stérilité est un impératif.
Vitesse - la santé des cellules cultivées est fortement liée à la quantité de temps les cellules ne sont pas dans une atmosphère et moyennes environnement contrôlé. Par conséquent, il est essentiel que le montant de temps requis pour enlever les cellules de l'animal jusqu'à ce les cellules sont dans le milieu d'étalement est à un minimum. Parce que de nombreuses mesures ne peuvent pas être modifiés (temps en incubation dans la trypsine ou d'être lavés), ce qui peut être modifié est le montant de temps requis pour enlever les cellules du cerveau. Pratique de la dissection souvent. Le montant de temps requis pour cette étape doit être reproductible.
Choix du support - il existe de nombreux médiums propriétaires, dont l'un est Neurobasal. Avant les jours de l'aide Neurobasal, moyen gliales conditionné (qui devaient être faites séparément - ce point est discuté dans le livre de banquier et Goslin 1) a été nécessaire. Peu importe, il est important que vous sachiez ce qui est dans la moyenne qui est utilisée. Avec Neurobasal, un supplément tel que B-27 est souvent utilisé. Assurez-vous que les constituants de ces moyennes et les suppléments sont connus, car ils peuvent affecter les propriétés des cellules. Il est pratique courante dans mon laboratoire à utiliser sans sérum / charbon dépouillé / phénol rouge moyen libres pour éviter les hormones stéroïdes (étant donné qu'une grande partie du travail effectué dans mon laboratoire étudie l'action des hormones stéroïdes). Ce concept - savoir ce qui est dans les solutions que vous utilisez - est essentiel pour toutes les étapes de culture cellulaire.
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Acknowledgments
JLN a été soutenue par MH 68347.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
