Summary
Proteases quebram ligações peptídicas. No laboratório, muitas vezes é necessário medir e / ou comparar a atividade de proteases. Não-específicas da Sigma ensaio de atividade protease pode ser usado como um procedimento padronizado para determinar a atividade de proteases.
Abstract
Proteases quebram ligações peptídicas. No laboratório, muitas vezes é necessário medir e / ou comparar a atividade de proteases. Não-específicas da Sigma ensaio de atividade protease pode ser usado como um procedimento padronizado para determinar a atividade de proteases, que é o que fazemos durante os nossos procedimentos de controle de qualidade. Neste ensaio, a caseína atua como um substrato. Quando a protease estamos testando digere caseína, o aminoácido tirosina é liberado junto com outros aminoácidos e fragmentos peptídicos. Reagente Folin e Ciocalteus Fenol, ou de Folin principalmente reage com tirosina livre para produzir um cromóforo de cor azul, que é quantificável e medida como um valor de absorbância no espectrofotômetro. Quanto mais tirosina que é liberado a partir de caseína, mais os cromóforos são geradas e mais forte é a atividade da protease. Valores de absorbância gerada pela atividade da protease são comparados a uma curva padrão, que é gerado pela reação de quantidades conhecidas de tirosina com o reagente FC para correlacionar mudanças na absorbância com a quantidade de tirosina em micromoles. Partir da curva padrão da atividade de protease amostras pode ser determinado em termos de unidades, que é a quantidade em micromoles de equivalentes de tirosina liberada a partir de caseína por minuto.
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Protocol
Antes de iniciar o ensaio, precisamos ter certeza de que os seguintes reagentes são corretamente preparado:
- Um tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7.5. Prepare com 11,4 mg / ml de fosfato de potássio dibásico, tri-hidratado em água purificada e ajustar o pH com HCl 1M. Esta solução é colocada a 37 ° C antes do uso.
- Uma solução de caseína de 0,65% peso / volume, preparada pela mistura de 6,5 mg / ml de caseína no tampão fosfato 50 mM de potássio. Aumentou gradualmente a temperatura da solução, com agitação suave para 80-85 ° C por aproximadamente 10 minutos até que uma dispersão homogênea é alcançado. É muito importante não ferver a solução. O pH é ajustado se necessário, com NaOH e HCl.
- A 110 mM Solução de ácido tricloroacético, preparada diluindo-se um estoque 6.1N 1:55 com água purificada. Ácido tricloroacético é um ácido forte e deve ser manuseado com cuidado.
- 0,5 mM Folin & Ciolcaltea, ou reagente fenol Folin, que é a solução que irá reagir com a tirosina para gerar uma mudança de cor mensuráveis que estará diretamente relacionada à atividade de proteases. Reagente Fenol Folin é um ácido e deve ser manuseado com cuidado.
- A 500 mM solução de carbonato de sódio é preparada com 53 mg / ml de carbonato de sódio anyhydrous em água purificada.
Uma solução diluente enzima, que consiste em 10 mM tampão acetato de sódio com acetato de cálcio 5mM, pH 7,5, a 37 ° C. Esta solução é o que usamos para dissolver amostras protease sólido ou soluções diluídas da enzima. - 1,1 mM L-tirosina solução estoque padrão. Preparados com 0,2 mg / ml L-tirosina em água purificada e aquecida suavemente até a tirosina se dissolve. Tal como acontece com a caseína, não ferver esta solução. Permitir que o padrão L-tirosina para esfriar a temperatura ambiente. Esta solução será diluída mais para tornar a nossa curva padrão.
- Solução de protease. Imediatamente antes de usar, dissolver em solução diluente protease enzima preparada no passo 6.
Se necessário, use uma amostra sólida protease de atividade pré-determinada, que é dissolvido utilizando diluente enzima para 0,1-0,2 unidades / ml. Esta solução serve como um controle positivo para o ensaio controle de qualidade e como validação para os cálculos vamos realizar para determinar a atividade da enzima.
Configurando o Ensaio Protease e Curvas Padrão
- Para começar este ensaio, encontrar frascos adequados que irá realizar cerca de 15 mls. Para cada enzima que será testado, 4 frascos são necessários. Um frasco será usado como um espaço em branco, e outros três serão utilizados para a atividade de ensaio de três diluições da protease. Três diluições são úteis ao verificar cálculos finais uns contra os outros.
- Para cada conjunto de quatro frascos, adicione 5mls da nossa solução de caseína de 0,65%. Deixe que eles se equilibram em banho-maria a 37 ° C por aproximadamente 5 minutos.
- Adicionar variados volumes de solução de enzima que será testado para três dos frascos de amostra de teste, mas não o branco. Mix agitando e incubar por 37 ° C por exatamente 10 minutos. A atividade de protease e libertação conseqüentes de tirosina durante este tempo de incubação é o que vai ser medido e comparado entre as amostras de teste.
- Após esta incubação 10 minutos, adicione o 5 mls do reagente TCA a cada tubo para parar a reação. Em seguida, adicione um volume adequado de solução de enzima a cada tubo, mesmo em branco, para que o volume final da solução de enzima em cada tubo é de 1 ml. Isto é feito para dar conta do valor da absorbância da enzima em si e para garantir que o volume final em cada tubo é igual. Incubar as soluções a 37 ° C por 30 minutos.
Durante esta incubação de 30 minutos, você pode querer configurar seu tirosina diluições padrão. Use dram 6 frascos (frascos dram pode ser substituído por tubos de polipropileno) que pode facilmente prender 8 mls. Aos seis frascos, adicione a 1,1 mM tirosina soluções estoque padrão com os seguintes volumes em mls: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Não adicione qualquer padrão de tirosina para o branco. Padrões mais baixos pode ser necessária para amostras impuras que trará mudança de cor pouco. Uma vez que a solução padrão de tirosina foi adicionado, adicione um volume adequado de água purificada a cada um dos padrões para obter um volume de 2 mls. - Após a incubação de 30 minutos, filtrar cada uma das soluções de teste e os em branco usando uma seringa de 0,45 polietersulfona filtro. Filtração é necessária para remover qualquer insolúveis das amostras.
- Adicionar a filtração 2 mls das amostras teste e filtrado em branco para 4 frascos dram que pode conter pelo menos 8 mls. O mesmo tipo de frasco nas quais as normas foram elaboradas podem ser usados.
- A todos os frascos contendo as normas e padrão em branco, adicione 5mls de carbonato de sódio. Para melhores resultados, adicionar 1 ml de reagente de Folin imediatamente depois.
- Adicionar carbonato de sódio para regular qualquer queda pH criado pela adição de reagente de Folin o.
- Adicionar carbonato de sódio, as amostras de teste e test em branco. Essas soluções tornam-se nublado, após a adição de carbonato de sódio. Adicionar o reagente Folin, que vai reagir principalmente com tirosina livre.
- Misture os frascos dram por agitação e incubar a 37 ° C por 30 minutos.
Medição de absorbância e Calculando Atividade Enzimática
- A absorbância das amostras é medida por um espectrofotômetro usando um comprimento de onda de 660 nm. O caminho da luz é definida como um centímetro. Registrar os valores de absorbância para os padrões, em branco padrão, as amostras de teste diferentes, e ensaio em branco. Depois de todos os dados tenham sido coletados, a curva padrão pode ser criado. , A fim de gerar a curva de diferença, em absorbância entre o branco ea norma deve ser calculado. Este é o valor de absorbância atribuível à quantidade de tirosina nas soluções padrão. Após esse cálculo simples, criar a curva padrão, utilizando um programa gráfico para plotar a variação da absorvância de nossos padrões no eixo Y, em relação ao montante em micromoles para cada um dos nossos 5 normas sobre o eixo X.
Volume de padrão de tirosina Tirosina uMoles 0,05 0,055 0,10 0,111 0,20 0,221 0,40 0,442 0,50 0,553 - Depois de pontos de dados foram inseridos, geram uma linha de melhor ajuste e inclinação equação correspondente.
Encontrar a variação de absorvância das amostras de teste através do cálculo da diferença entre a absorbância da amostra de teste ea absorbância do ensaio em branco. Inserindo o valor de absorbância para uma das amostras na equação inclinação e resolução resultará na micromoles de tirosina liberada durante esta reação proteolítica particular. Para obter a atividade da enzima em unidades por / ml, executar o seguinte cálculo:
(Umole equivalentes tirosina liberada) x (11)
Unidades / ml = Enzyme __________________________________________
(1) x (10) x (2)
11 = volume total (em mililitros) de ensaio
10 = Tempo de ensaio (em minutos) de acordo com a definição da Unidade
1 = Volume da enzima (em mililitros) de enzima usada
2 = Volume (em mililitros) utilizados na determinação colorimétrica
Tome o número de equivalentes micromoles tirosina liberados obtidos a partir da equação inclinação e multiplicá-lo pelo volume total do ensaio em mls, que no nosso caso é 11mls. Divida esse valor por três outras quantidades: o tempo do ensaio, que durou 10 minutos, o volume de enzima utilizada no ensaio, que foi variado (vamos usar 1ml), o volume de mililitros usado na detecção colorimétrica, o que pode diferem com base em seu cuvete. Nós usamos 2 mls. - Micromoles de tirosina dividida pelo tempo em minutos de medição rendimentos da atividade da protease chamado de "unidades". Podemos cancelar as unidades de medição de volume no numerador e denominador, deixando um measurment da atividade enzimática em termos de unidades / ml. A fim de determinar a atividade em uma amostra sólida protease diluído em diluente enzima, dividimos a nossa actividade em unidades / ml pela concentração de sólidos utilizados neste ensaio originalmente em mg / ml., Deixando-nos com a atividade em termos de unidades / mg .
Unidades / ml de enzima
Unidades / mg sólida = _____________________
mg sólido / ml de enzima
Discussion
Nós apenas mostramos como analisar a atividade da protease usando ensaio da Sigma atividade universal protease. Além disso, este ensaio é útil para garantir que nossos proteases têm precisamente determinada atividade antes de recebê-los para suas experiências. Como você viu, ao fazer este procedimento, é de fundamental importância para lembrar para aquecer tanto a caseína e soluções tirosina lentamente e não fervê-los. Além disso, é fundamental para preparar espaços diferentes para ambos os padrões do seu e para cada amostra de teste que você tem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease | Sigma-Aldrich | P4630 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078 | |
| Trichloroacetic Acid | Sigma-Aldrich | T0699 | |
| Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent | Sigma-Aldrich | F9252 | |
| Sodium Carbonate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | S2127 | |
| Sodium Acetate, Trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625 | |
| Calcium Acetate | Sigma-Aldrich | C1000 | |
| L-Tyrosine, Free Base | Sigma-Aldrich | T3754 | |
| Protease Profiler Kit | Sigma-Aldrich | PP0500 | |
| Protease Fluorescent Detection Kit | Sigma-Aldrich | PF0100 |
References
- Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
- Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).
