Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

سيجما للنشاط غير محددة البروتياز الفحص -- باعتباره الركيزة الكازين

doi: 10.3791/899 Published: September 17, 2008

Summary

البروتياز كسر سندات ببتيد. في المختبر ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لقياس و / أو مقارنة نشاط البروتياز. ويمكن استخدام سيجما نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة مقايسة وإجراءات موحدة لتحديد نشاط البروتياز.

Abstract

البروتياز كسر سندات ببتيد. في المختبر ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لقياس و / أو مقارنة نشاط البروتياز. ويمكن استخدام سيجما نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة مقايسة وإجراءات موحدة لتحديد نشاط البروتياز ، وهو ما نقوم به خلال إجراءات مراقبة الجودة لدينا. في هذا الاختبار ، الكازين بمثابة الركيزة. عندما البروتيني نحن اختبار الكازين هضم ، والأحماض الأمينية التيروسين يتحرر جنبا إلى جنب مع غيرها من الأحماض الأمينية وشظايا الببتيد. كاشف فولين وCiocalteus الفينول ، أو في المقام الأول فولين يتفاعل مع التيروزين مجانا لإنتاج حامل اللون الأزرق اللون ، الذي هو قياس الكمي وكقيمة الامتصاصية على معمل. أكثر التيروزين التي يتم تحريرها من الكازين ، وأكثر يتم إنشاء chromophores وأقوى من نشاط الأنزيم البروتيني. تتم مقارنة القيم الامتصاصية التي تم إنشاؤها بواسطة نشاط الأنزيم البروتيني إلى منحنى القياسية ، التي تم إنشاؤها بواسطة تفاعل كميات معروفة من التيروزين مع كاشف FC لربط التغيرات في الامتصاصية مع مبلغ من التيروزين في micromoles. ويمكن من المنحنى القياسي يحدد نشاط الأنزيم البروتيني عينات من حيث الوحدات ، وهو المبلغ الذي micromoles في المعادلة التيروزين أفرج عنه من الكازين في الدقيقة الواحدة.

لعرض هذه المادة باللغة الصينية ، انقر هنا

Protocol

قبل البدء في عملية الفحص ، ونحن بحاجة للتأكد من أن يتم إعداد بشكل صحيح الكواشف التالية :

  1. وفوسفات البوتاسيوم 50 ملي العازلة ، ودرجة الحموضة 7.5. يعد استخدام 11.4 ملغ / مل من ثنائي القاعدة phospate البوتاسيوم ، هيدرات في تنقية المياه وتعديل درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك 1M. يتم وضع هذا الحل في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. A 0.65 ٪ حل الكازين الوزن / الحجم ، التي أعدها خلط 6،5 ملغ / مل من الكازين في المنطقة العازلة 50 مم فوسفات البوتاسيوم. زيادة درجة الحرارة تدريجيا مع التحريك حل لطيف 80-85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا حتى يتم التوصل إلى تشتت متجانسة. فمن المهم جدا ألا يغلي الحل. ثم يتم تعديل درجة الحموضة إذا لزم الأمر مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك.
  3. A 110 ملي حل حمض حمض التريكلوروسيتيك ، التي أعدها تمييع a 1:55 الأسهم 6.1N مع تنقية المياه. حمض التريكلوروسيتيك حمض هو حمض قوي ، وينبغي التعامل معها بحذر.
  4. 0.5 مم و فولين Ciolcaltea ، أو الكاشف فولين الفينول ، والذي هو الحل الذي سوف تتفاعل مع التيروزين لتوليد تغيير لون قياسها التي من شأنها أن تكون ذات صلة مباشرة الى نشاط البروتياز. الكاشف فولين هو حمض الفينول ، وينبغي التعامل معها بحذر.
  5. والصوديوم 500 مم حل كربونات ، أعدت باستخدام 53 ملغم / لتر من كربونات الصوديوم في المياه النقية anyhydrous.
    حلا مخفف الانزيم الذي يتكون من 10 ملي خلات الصوديوم العازلة مع خلات الكالسيوم 5mm ، و 7.5 درجة الحموضة ، في 37 درجة مئوية. هذا الحل هو ما نستخدمه لإذابة العينات البروتيني صلبة أو تمييع حلول الانزيم.
  6. L - 1.1 ملم التيروزين محلول المخزون قياسي. أعدت باستخدام 0.2 ملغ / مل L - التيروزين في تنقية المياه وتسخينها برفق حتى يذوب التيروزين. كما هو الحال مع الكازين ، لا تغلي هذا الحل. يسمح المعيار L - التيروزين لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. وسوف تضعف هذا الحل أخرى لجعل منحنى لدينا القياسية.
  7. البروتيني الحل. على الفور قبل استخدامه ، ويحل في محلول مخفف البروتيني الانزيم أعد في الخطوة 6.

إذا كان ذلك ضروريا ، واستخدام عينة صلبة من نشاط الأنزيم البروتيني محددة سلفا ، والتي حلت به مخفف لانزيم 0،1-0،2 وحدة / مل. هذا الحل بمثابة مراقبة إيجابية على جودة الفحص والرقابة والتحقق من صحة الحسابات ونحن سوف تؤدي إلى تحديد نشاط انزيم.

إعداد الفحص البروتياز والمنحنيات القياسية

  1. لنبدأ هذا الاختبار ، والعثور على قنينة المناسبة التي ستعقد حوالي 15 مليليتر. لكل الانزيم الذي سيتم اختباره ، وهناك حاجة إلى 4 قوارير. وسيتم استخدام قارورة واحدة باعتبارها فارغة ، وسيتم استخدام ثلاثة آخرين لفحص النشاط ثلاثة من التخفيفات البروتيني. التخفيفات ثلاثة مفيدة عند فحص الحسابات النهائية ضد بعضها البعض.
    1. على كل مجموعة من أربع قوارير ، إضافة 5mls من حلنا الكازين 0.65 ٪. دعوهم توازن في حمام مائي عند 37 لمدة 5 دقائق درجة مئوية.
    2. إضافة أحجام متفاوتة حل الانزيم الذي سيتم اختبار لثلاث من قوارير عينة الاختبار ، ولكن ليس فارغا. مزيج من قبل دوامات واحتضان لمدة 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق بالضبط. نشاط الأنزيم البروتيني والتحرر من التبعية التيروزين خلال هذه الفترة الحضانة هو ما سيتم قياس ومقارنة بين عينات الاختبار.
  2. بعد هذا الاحتضان 10 دقيقة ، إضافة ملل 5 من كاشف TCA إلى كل أنبوب لمنع رد الفعل. ثم ، إضافة حجم مناسب لانزيم حل لكل أنبوب ، حتى فارغة ، بحيث الحجم النهائي من الحل الانزيم في كل أنبوب 1 مل. يتم ذلك لحساب قيمة الامتصاصية للانزيم نفسها ، لضمان أن حجم النهائي في كل أنبوب هو على قدم المساواة. احتضان الحلول في 37 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية.


    خلال هذه الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قد تحتاج لإعداد المعيار الخاص التخفيفات التيروزين. 6 الدرام استخدام قوارير (يمكن استبداله قارورة الدرام مع أنابيب البولي بروبلين) التي يمكن أن تعقد بسهولة 8 ملل. الى قارورة ستة إضافة 1.1 ملم التيروزين الحلول الأسهم القياسية مع وحدات التخزين التالية في ملل : 0.05 ، 0.10 ، 0.20 ، 0.40 ، 0.50. لا تضف أي معيار التيروزين إلى فارغة. قد تكون هناك حاجة لخفض معايير اختبار عينات من النجاسة التي سوف تسفر قليلا تغيير اللون. مرة واحدة تم إضافة حل التيروزين القياسية ، إضافة حجم مناسب من الماء النقي الى كل من معايير لتحقيق وحدة التخزين إلى 2 ملل.
  3. بعد حضانة لمدة 30 دقيقة ، كل مرشح للحلول اختبار فارغة وباستخدام حقنة 0.45 ميكرون polyethersulfone التصفية. مطلوب الترشيح لإزالة أي insolubles من العينات.
    1. إضافة ترشيح 2 ملل من عينات الاختبار والترشيح للقوارير فارغة الدرام 4 التي يمكن أن تعقد ما لا يقل عن 8 ملل. ويمكن استخدام نفس النوع من القنينة التي أعدت المعايير.
    2. إلى كل من قوارير تحتوي على المعايير القياسية ، وفارغة ، إضافة 5mls من كربونات الصوديوم. للحصول على أفضل النتائج ، إضافة 1 مل من كاشف فولين بعد ذلك على الفور.
    3. إضافة كربونات الصوديوم لتنظيم أي انخفاض الرقم الهيدروجيني إنشاؤها بواسطة إضافة كاشف للفولين.
    4. إضافة كربونات الصوديوم للعينات الاختبار والاحصائيينر فارغة. هذه الحلول يصبح غائما بعد إضافة كربونات الصوديوم. إضافة كاشف للفولين ، والتي سترد في المقام الأول مع التيروزين الحرة.
    5. مزيج قارورة الدرام التي تدور في احتضان و37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    بعد هذه الحضانة ، يجب أن تلاحظ أن معايير لها تدرج اللون رابطا مع مبلغ من التيروزين المضافة ؛ أعلى تركيزات التيروزين أحلك الظهور. يمكنك تلاحظ أيضا تغيير لون ملموس في عينات الاختبار. 2mls يتم تصفيتها من هذه الحلول باستخدام حقنة 0.45 polyethersulfone أم تصفية في cuvettes مناسبة. والآن بعد أن يتم تنفيذ الفحص ، يمكنك الشروع في معمل لتسجيل القيم الامتصاصية لدينا.

قياس وحساب امتصاص نشاط انزيم

  1. يتم قياس الامتصاصية للعينات من قبل معمل باستخدام الطول الموجي 660nm. يتم تعيين مسار الضوء ل1cm. سجل القيم الامتصاصية للمعايير وفارغ القياسية ، واختبار عينات مختلفة ، واختبار فارغة. مرة واحدة وقد تم جمع كافة البيانات ، يمكن إنشاء منحنى القياسية. يجب أن تكون محسوبة من أجل توليد المنحنى ، الاختلاف في الامتصاصية بين فارغة القياسية والمعايير. هذه هي القيمة التي تعزى إلى امتصاص كمية التيروزين في الحلول القياسية. بعد هذه العملية الحسابية البسيطة ، وخلق منحنى قياسي باستخدام برنامج الرسوم البيانية لرسم التغير في الامتصاصية من معاييرنا على المحور Y ، مقابل المبلغ المذكور في micromoles لكل من المعايير لدينا 5 على المحور X.

    حجم قياسي التيروسين uMoles التيروسين
    0.05 0،055
    0.10 0،111
    0.20 0،221
    0.40 0،442
    0.50 0،553
  2. بعد أن تم إدخال نقاط البيانات ، إنشاء خط لأفضل لائقا والمناظرة المعادلة المنحدر.


    العثور على التغير في الامتصاصية في اختبار العينات عن طريق حساب الفرق بين عينة اختبار الامتصاصية والامتصاصية لاختبار فارغة. وإدراج قيمة الامتصاصية لأحد عينات اختبار في المعادلة المنحدر وحل النتيجة في micromoles المحررة من خلال هذا التفاعل التيروزين بروتين معين. للحصول على نشاط انزيم في وحدة في / مل ، وإجراء العملية الحسابية التالية :


    (المعادل التيروزين umole أفرج) × (11)
    وحدة / مل = أنزيم _________________________

    (1) × (10) × (2)


    11 = الحجم الكلي (في مل) من مقايسة
    10 = وقت مقايسة (بالدقائق) وفقا لتعريف وحدة
    1 = حجم استخدام انزيم (في مل) من أنزيم
    2 = المجلد (في ملليلتر) المستخدمة في تحديد اللونية


    اتخاذ عدد من مكافئات micromoles التيروزين سراح الحصول عليها من معادلة الانحدار واضربها في الحجم الكلي للمقايسة في ملل ، والذي هو في حالتنا 11mls. تقسيم هذه القيمة من قبل ثلاثة كميات أخرى : الوقت للمقايسة ، والتي ركضنا لمدة 10 دقيقة ، وحجم انزيم المستخدمة في فحص ، الذي كان المتنوعة (دعونا نستخدم 1ml) ، وحجم ملليلتر المستخدمة في الكشف عن اللونية ، والتي قد تختلف استنادا كفيت الخاص. كنا 2 ملل.
  3. Micromoles من التيروزين مقسوما الوقت في قياس عوائد دقيقة من النشاط البروتيني يسمى "الوحدات الخاصة". يمكننا أن يلغي وحدة لقياس الحجم في البسط والمقام ، وترك قيس من نشاط انزيم من حيث وحدة / مل. من أجل تحديد نشاط الأنزيم البروتيني في عينة صلبة مخففة في انزيم مخفف ، نقسم نشاطنا في وحدة / مل من تركيز المواد الصلبة المستخدمة في هذا الاختبار في الأصل ملغ / مل. ، وترك لنا مع النشاط من حيث وحدة / ملغ .


    وحدة / مل انزيم
    الوحدات / الصلبة ملغ = _____________________

    ملغ الصلبة / انزيم مل

Discussion

لقد أظهرنا لكم فقط كيفية تحليل نشاط الأنزيم البروتيني باستخدام سيغما نشاط الأنزيم البروتيني مقايسة عالمية. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الاختبار هو مفيد للتأكد من أن لدينا البروتياز تحدد بدقة النشاط قبل الحصول عليها عن تجاربك. كما رأيتم ، عند القيام بهذا الإجراء ، فإنه من الأهمية بمكان أن نتذكر أن كلا من الحرارة الكازين والحلول التيروزين ببطء وعدم سلقها. أيضا ، من المهم جدا لإعداد الفراغات المختلفة لكل من المعايير الخاصة بك ولكل عينة الاختبار التي لديك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Sigma-Aldrich P4630
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Casein Sigma-Aldrich C7078
Trichloroacetic Acid Sigma-Aldrich T0699
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent Sigma-Aldrich F9252
Sodium Carbonate, Anhydrous Sigma-Aldrich S2127
Sodium Acetate, Trihydrate Sigma-Aldrich S8625
Calcium Acetate Sigma-Aldrich C1000
L-Tyrosine, Free Base Sigma-Aldrich T3754
Protease Profiler Kit Sigma-Aldrich PP0500
Protease Fluorescent Detection Kit Sigma-Aldrich PF0100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
  2. Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).
سيجما للنشاط غير محددة البروتياز الفحص -- باعتباره الركيزة الكازين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).More

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter