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Biology

Sigma的非特异性蛋白酶活性测定 - 酪蛋白作为基质

doi: 10.3791/899 Published: September 17, 2008

Summary

蛋白酶打破肽键。在实验室中,它往往是必要的,来衡量和/或比较蛋白酶的活性。 Sigma的非特异性的蛋白酶活性检测可作为一个标准化的程序,以确定蛋白酶的活性。

Abstract

蛋白酶打破肽键。在实验室中,它往往是必要的,来衡量和/或比较蛋白酶的活性。 Sigma的非特异性的蛋白酶活性检测可作为一个标准化的程序,以确定蛋白酶的活性,这是我们在我们的质量控制程序。在这个实验中,酪蛋白作为基板。当我们正在测试的蛋白酶消化酪蛋白,氨基酸酪氨酸是沿解放与其他的氨基酸和肽片段。福林和Ciocalteus苯酚,或福林的试剂主要是反应与自由的酪氨酸产生蓝色生色,这是量化和分光光度计的吸光度值来衡量。从酪蛋白释放更多的酪氨酸,更生色团产生较强的蛋白酶的活性。蛋白酶的活动所产生的吸光度值相比,这是已知数量的酪氨酸反应与FC试剂关联吸光度的变化量在微摩尔酪氨酸产生的标准曲线。从标准曲线的活性蛋白酶样品,可以在单位,这是在微摩尔每分钟从酪蛋白释放的酪氨酸等值金额方面确定。

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Protocol

在开始检测之前,我们需要确保正确地准备以下试剂:

  1. 50毫米的磷酸钾缓冲液,pH值7.5。准备用11.4毫克/毫升,钾phospate二元,纯净水,用1M盐酸调节pH值的三水。这个解决方案是在37 ° C,使用前放置。
  2. 一个0.65%重量/体积的酪蛋白溶液,混合,在50 mM磷酸钾缓冲6.5毫克/毫升酪蛋白准备。逐渐升高溶液温度80-85℃,约10分钟轻轻搅拌,直到均匀的分散实现。这是非常重要的是不要熬的解决方案。必要时用NaOH和HCl调整pH值。
  3. 一个110毫米的三氯乙酸溶液,用纯净水稀释一个6.1N股票1:55准备。三氯乙酸是一种强酸,应小心处理。
  4. 0.5毫米福林Ciolcaltea的,或福林酚试剂,这是解决方案,将与酪氨酸反应,生成一个可衡量的的颜色变化,将直接关系到蛋白酶的活性。福林酚试剂是一种酸,应谨慎处理。
  5. 500毫米碳酸钠的解决方案,准备使用纯净水53毫克/毫升的anyhydrous碳酸钠。
    一种酶稀释剂的解决方案,其中包括10 mM磷酸钠,醋酸钙5MM醋酸缓冲液,pH值7.5,在37 ° C。这个解决方案是我们用来溶解固体蛋白酶样品或稀释酶解决方案。
  6. 1.1毫米L -酪氨酸的标准储备溶液。准备使用0.2 mg / ml的L -酪氨酸,在纯净水和加热,轻轻酪氨酸溶解。与酪蛋白,这种解决方案不开锅。 L -酪氨酸的标准冷却到室温。该解决方案将进一步被摊薄,使我们的标准曲线。
  7. 蛋白酶的解决方案。使用前,溶解蛋白酶的酶稀释液在第6步准备的解决方案。

如果有必要,使用了预定的活动奠定坚实的蛋白酶样品,这是用酶稀释液0.1-0.2单位/ ml溶解。该解决方案作为一个质量控制检测的阳性对照和验证的计算,我们将执行确定酶的活性。

设立蛋白酶含​​量及标准曲线

  1. 要开始这个实验中,找到合适的,将举行约15毫升的小瓶。对于每个将被测试的酶,需要4瓶。一小瓶将被用来作为一个空白,和其他三人将被用来检测三个稀释的蛋白酶活性。三稀释检查时,对对方的最终计算是有用的。
    1. 每一套四瓶,添加0.65%酪蛋白溶液5mls。让他们在37℃水浴平衡5分钟左右彗星。
    2. 添加不同的酶液,将被测试的测试样品瓶三个卷,但不是空白。混合纷飞和37 ° C孵育整整10分钟。蛋白酶活性和酪氨酸相应的解放,在这个孵化时间是将被测量和比较试验样品。
  2. 这10分钟的潜伏期后,每管加入5毫升的TCA试剂终止反应。然后,添加适当的酶液量,以每管,甚至空白,使酶液,每管最终成交量是1毫升。这样做是考虑到酶本身的吸光度值,以确保在每管的最后体积等于。的解决方案在37 ° C下30分钟。


    在这30分钟的孵育,您可能需要设置您的酪氨酸标准稀释。使用6 DRAM小瓶(DRAM小瓶,可取代聚丙烯管),可以轻松容纳8 MLS。到六瓶,加入MLS以下几卷的1.1毫米酪氨酸的标准储备溶液:0.05,0.10,0.20,0.40,0.50。不添加任何酪氨酸标准的空白。不纯的测试样本,将产生的颜色变化不大,可能需要降低标准。一旦酪氨酸标准溶液已被添加,添加适当体积的纯净水标准,把2毫升的量。
  3. 经过30分钟的孵化,筛选每个测试解决方案,并使用0.45微米的聚醚砜注射器过滤器的空白。过滤器是必需的,从样本中删除任何不溶物。
    1. 过滤测试样品2毫升和空白滤液4 DRAM小瓶,可容纳至少8 MLS。可以使用同一类型的小瓶,其中的标准准备。
    2. 所有的小瓶含有的标准和标准的空白,添加碳酸钠5mls。为了达到最佳效果,随即添加1毫升福林的试剂。
    3. 添加碳酸钠规范福林试剂除了创建任何pH值下降。
    4. 添加碳酸钠,测试样品和工商业污水附加费t空白。这些解决方案成为后的碳酸钠除了阴天。新增的福林试剂,将主要免费酪氨酸反应。
    5. 混合纷飞的DRAM小瓶,并在37 ° C孵育30分钟。
    此潜伏期后,你应该注意到,标准的色阶与酪氨酸添加量相关的;酪氨酸的最高浓度出现的最黑暗的。您也可以通知我们的测试样本中明显的颜色变化。这些解决方案2mls到合适的试管中使用0.45微米的聚醚砜注射器过滤器过滤。现在进行检测,你可以继续分光光度计记录我们的吸光度值。

测吸光度,计算酶的活性

  1. 一个使用660nm波长的分光光度计测量样品的吸光度。光路设置为1cm。记录的标准,标准的空白,不同的测试样本,和测试空白的吸光度值。一旦所有的数据都已经收集,可以创建标准曲线。为了生成的曲线,在吸光度之间的​​标准和标准的空白差异,必须计算。这是吸光度值占酪氨酸量标准的解决方案。这个简单的计算后,建立标准曲线,使用图形程序绘制Y轴的改变,在我们的标准的吸光度,对我们的5 X轴的标准量在微摩尔。

    酪氨酸标准卷 uMoles酪氨酸
    0.05 0.055
    0.10 0.111
    0.20 0.221
    0.40 0.442
    0.50 0.553
  2. 已输入的数据点后,生成一个最适合和相应的缓坡方程的行。


    查找计算测试样品的吸光度和测试空白的吸光度之间的​​差异的测试样品的光吸收变化。插入缓坡方程的一个测试样品的吸光度值和解决,将导致酪氨酸解放微摩尔在这个特殊的蛋白水解反应。为了得到每单位/毫升的活性酶,执行下列计算:


    (发布umole酪氨酸等效)×(11)
    单位/毫升酶= _________________________________________

    (1)X(10)×(2)


    11 =总体积(毫升)的测定
    10 =时间法(分钟)为单位定义
    1 =酶的酶量(毫升)使用
    2 =体积(毫升)比色法测定


    以微摩尔酪氨酸从缓坡方程获得等值发布的数量和乘以MLS的检测,这在我们的例子是11mls总量。的酶量的检测中使用,分成三个其他数量这个值:的检测,其中我们10分钟跑的时候,是不同的(的使用1毫升),的比色法检测毫升的量,这可能你的比色皿不同的基础上。我们用2毫升。
  3. 按时间分为酪氨酸微摩尔分钟产量蛋白酶活性的所谓“单位”的测量。我们可以取消了单位体积中的分子和分母的测量,留在单位/ ml酶的活性measurment。为了确定了坚实的蛋白酶的酶稀释液稀释后的样品的活性,分裂我们的活动,在单位/毫升浓度毫克/毫升。原本在这个实验中使用的固体,留给我们单位/ mg活动。


    单位/毫升酶
    单位/ mg固体= ____________________

    固体毫克/毫升酶

Discussion

我们刚刚向您展示了如何使用Sigma的普遍蛋白酶活性测定分析蛋白酶活性。此外,这种检测,以确保我们蛋白酶精确确定活动之前,您将收到您的实验,他们是有用的。正如您所看到的,在执行此过程时,记得要热的酪蛋白和酪氨酸的解决方案,慢慢地熬他们最重​​要的。此外,它的关键,以备您的标准和每个测试样本,你有不同的空白。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Sigma-Aldrich P4630
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Casein Sigma-Aldrich C7078
Trichloroacetic Acid Sigma-Aldrich T0699
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent Sigma-Aldrich F9252
Sodium Carbonate, Anhydrous Sigma-Aldrich S2127
Sodium Acetate, Trihydrate Sigma-Aldrich S8625
Calcium Acetate Sigma-Aldrich C1000
L-Tyrosine, Free Base Sigma-Aldrich T3754
Protease Profiler Kit Sigma-Aldrich PP0500
Protease Fluorescent Detection Kit Sigma-Aldrich PF0100

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References

  1. Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
  2. Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).
Sigma的非特异性蛋白酶活性测定 - 酪蛋白作为基质
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Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).More

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).

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