Summary
蛋白酶打破肽键。在实验室中,它往往是必要的,来衡量和/或比较蛋白酶的活性。 Sigma的非特异性的蛋白酶活性检测可作为一个标准化的程序,以确定蛋白酶的活性。
Abstract
蛋白酶打破肽键。在实验室中,它往往是必要的,来衡量和/或比较蛋白酶的活性。 Sigma的非特异性的蛋白酶活性检测可作为一个标准化的程序,以确定蛋白酶的活性,这是我们在我们的质量控制程序。在这个实验中,酪蛋白作为基板。当我们正在测试的蛋白酶消化酪蛋白,氨基酸酪氨酸是沿解放与其他的氨基酸和肽片段。福林和Ciocalteus苯酚,或福林的试剂主要是反应与自由的酪氨酸产生蓝色生色,这是量化和分光光度计的吸光度值来衡量。从酪蛋白释放更多的酪氨酸,更生色团产生较强的蛋白酶的活性。蛋白酶的活动所产生的吸光度值相比,这是已知数量的酪氨酸反应与FC试剂关联吸光度的变化量在微摩尔酪氨酸产生的标准曲线。从标准曲线的活性蛋白酶样品,可以在单位,这是在微摩尔每分钟从酪蛋白释放的酪氨酸等值金额方面确定。
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Protocol
在开始检测之前,我们需要确保正确地准备以下试剂:
- 50毫米的磷酸钾缓冲液,pH值7.5。准备用11.4毫克/毫升,钾phospate二元,纯净水,用1M盐酸调节pH值的三水。这个解决方案是在37 ° C,使用前放置。
- 一个0.65%重量/体积的酪蛋白溶液,混合,在50 mM磷酸钾缓冲6.5毫克/毫升酪蛋白准备。逐渐升高溶液温度80-85℃,约10分钟轻轻搅拌,直到均匀的分散实现。这是非常重要的是不要熬的解决方案。必要时用NaOH和HCl调整pH值。
- 一个110毫米的三氯乙酸溶液,用纯净水稀释一个6.1N股票1:55准备。三氯乙酸是一种强酸,应小心处理。
- 0.5毫米福林Ciolcaltea的,或福林酚试剂,这是解决方案,将与酪氨酸反应,生成一个可衡量的的颜色变化,将直接关系到蛋白酶的活性。福林酚试剂是一种酸,应谨慎处理。
- 500毫米碳酸钠的解决方案,准备使用纯净水53毫克/毫升的anyhydrous碳酸钠。
一种酶稀释剂的解决方案,其中包括10 mM磷酸钠,醋酸钙5MM醋酸缓冲液,pH值7.5,在37 ° C。这个解决方案是我们用来溶解固体蛋白酶样品或稀释酶解决方案。 - 1.1毫米L -酪氨酸的标准储备溶液。准备使用0.2 mg / ml的L -酪氨酸,在纯净水和加热,轻轻酪氨酸溶解。与酪蛋白,这种解决方案不开锅。 L -酪氨酸的标准冷却到室温。该解决方案将进一步被摊薄,使我们的标准曲线。
- 蛋白酶的解决方案。使用前,溶解蛋白酶的酶稀释液在第6步准备的解决方案。
如果有必要,使用了预定的活动奠定坚实的蛋白酶样品,这是用酶稀释液0.1-0.2单位/ ml溶解。该解决方案作为一个质量控制检测的阳性对照和验证的计算,我们将执行确定酶的活性。
设立蛋白酶含量及标准曲线
- 要开始这个实验中,找到合适的,将举行约15毫升的小瓶。对于每个将被测试的酶,需要4瓶。一小瓶将被用来作为一个空白,和其他三人将被用来检测三个稀释的蛋白酶活性。三稀释检查时,对对方的最终计算是有用的。
- 每一套四瓶,添加0.65%酪蛋白溶液5mls。让他们在37℃水浴平衡5分钟左右彗星。
- 添加不同的酶液,将被测试的测试样品瓶三个卷,但不是空白。混合纷飞和37 ° C孵育整整10分钟。蛋白酶活性和酪氨酸相应的解放,在这个孵化时间是将被测量和比较试验样品。
- 这10分钟的潜伏期后,每管加入5毫升的TCA试剂终止反应。然后,添加适当的酶液量,以每管,甚至空白,使酶液,每管最终成交量是1毫升。这样做是考虑到酶本身的吸光度值,以确保在每管的最后体积等于。的解决方案在37 ° C下30分钟。
在这30分钟的孵育,您可能需要设置您的酪氨酸标准稀释。使用6 DRAM小瓶(DRAM小瓶,可取代聚丙烯管),可以轻松容纳8 MLS。到六瓶,加入MLS以下几卷的1.1毫米酪氨酸的标准储备溶液:0.05,0.10,0.20,0.40,0.50。不添加任何酪氨酸标准的空白。不纯的测试样本,将产生的颜色变化不大,可能需要降低标准。一旦酪氨酸标准溶液已被添加,添加适当体积的纯净水标准,把2毫升的量。 - 经过30分钟的孵化,筛选每个测试解决方案,并使用0.45微米的聚醚砜注射器过滤器的空白。过滤器是必需的,从样本中删除任何不溶物。
- 过滤测试样品2毫升和空白滤液4 DRAM小瓶,可容纳至少8 MLS。可以使用同一类型的小瓶,其中的标准准备。
- 所有的小瓶含有的标准和标准的空白,添加碳酸钠5mls。为了达到最佳效果,随即添加1毫升福林的试剂。
- 添加碳酸钠规范福林试剂除了创建任何pH值下降。
- 添加碳酸钠,测试样品和工商业污水附加费t空白。这些解决方案成为后的碳酸钠除了阴天。新增的福林试剂,将主要免费酪氨酸反应。
- 混合纷飞的DRAM小瓶,并在37 ° C孵育30分钟。
测吸光度,计算酶的活性
- 一个使用660nm波长的分光光度计测量样品的吸光度。光路设置为1cm。记录的标准,标准的空白,不同的测试样本,和测试空白的吸光度值。一旦所有的数据都已经收集,可以创建标准曲线。为了生成的曲线,在吸光度之间的标准和标准的空白差异,必须计算。这是吸光度值占酪氨酸量标准的解决方案。这个简单的计算后,建立标准曲线,使用图形程序绘制Y轴的改变,在我们的标准的吸光度,对我们的5 X轴的标准量在微摩尔。
酪氨酸标准卷 uMoles酪氨酸 0.05 0.055 0.10 0.111 0.20 0.221 0.40 0.442 0.50 0.553 - 已输入的数据点后,生成一个最适合和相应的缓坡方程的行。
查找计算测试样品的吸光度和测试空白的吸光度之间的差异的测试样品的光吸收变化。插入缓坡方程的一个测试样品的吸光度值和解决,将导致酪氨酸解放微摩尔在这个特殊的蛋白水解反应。为了得到每单位/毫升的活性酶,执行下列计算:
(发布umole酪氨酸等效)×(11)
单位/毫升酶= _________________________________________
(1)X(10)×(2)
11 =总体积(毫升)的测定
10 =时间法(分钟)为单位定义
1 =酶的酶量(毫升)使用
2 =体积(毫升)比色法测定
以微摩尔酪氨酸从缓坡方程获得等值发布的数量和乘以MLS的检测,这在我们的例子是11mls总量。的酶量的检测中使用,分成三个其他数量这个值:的检测,其中我们10分钟跑的时候,是不同的(的使用1毫升),的比色法检测毫升的量,这可能你的比色皿不同的基础上。我们用2毫升。 - 按时间分为酪氨酸微摩尔分钟产量蛋白酶活性的所谓“单位”的测量。我们可以取消了单位体积中的分子和分母的测量,留在单位/ ml酶的活性measurment。为了确定了坚实的蛋白酶的酶稀释液稀释后的样品的活性,分裂我们的活动,在单位/毫升浓度毫克/毫升。原本在这个实验中使用的固体,留给我们单位/ mg活动。
单位/毫升酶
单位/ mg固体= ____________________
固体毫克/毫升酶
Discussion
我们刚刚向您展示了如何使用Sigma的普遍蛋白酶活性测定分析蛋白酶活性。此外,这种检测,以确保我们蛋白酶精确确定活动之前,您将收到您的实验,他们是有用的。正如您所看到的,在执行此过程时,记得要热的酪蛋白和酪氨酸的解决方案,慢慢地熬他们最重要的。此外,它的关键,以备您的标准和每个测试样本,你有不同的空白。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Protease | Sigma-Aldrich | P4630 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate | Sigma-Aldrich | P5504 | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078 | |
Trichloroacetic Acid | Sigma-Aldrich | T0699 | |
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent | Sigma-Aldrich | F9252 | |
Sodium Carbonate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | S2127 | |
Sodium Acetate, Trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625 | |
Calcium Acetate | Sigma-Aldrich | C1000 | |
L-Tyrosine, Free Base | Sigma-Aldrich | T3754 | |
Protease Profiler Kit | Sigma-Aldrich | PP0500 | |
Protease Fluorescent Detection Kit | Sigma-Aldrich | PF0100 |
References
- Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
- Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).