Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Não-específicas da Sigma ensaio de atividade de protease - A caseína como substrato

doi: 10.3791/899 Published: September 17, 2008

Summary

Proteases quebram ligações peptídicas. No laboratório, muitas vezes é necessário medir e / ou comparar a atividade de proteases. Não-específicas da Sigma ensaio de atividade protease pode ser usado como um procedimento padronizado para determinar a atividade de proteases.

Abstract

Proteases quebram ligações peptídicas. No laboratório, muitas vezes é necessário medir e / ou comparar a atividade de proteases. Não-específicas da Sigma ensaio de atividade protease pode ser usado como um procedimento padronizado para determinar a atividade de proteases, que é o que fazemos durante os nossos procedimentos de controle de qualidade. Neste ensaio, a caseína atua como um substrato. Quando a protease estamos testando digere caseína, o aminoácido tirosina é liberado junto com outros aminoácidos e fragmentos peptídicos. Reagente Folin e Ciocalteus Fenol, ou de Folin principalmente reage com tirosina livre para produzir um cromóforo de cor azul, que é quantificável e medida como um valor de absorbância no espectrofotômetro. Quanto mais tirosina que é liberado a partir de caseína, mais os cromóforos são geradas e mais forte é a atividade da protease. Valores de absorbância gerada pela atividade da protease são comparados a uma curva padrão, que é gerado pela reação de quantidades conhecidas de tirosina com o reagente FC para correlacionar mudanças na absorbância com a quantidade de tirosina em micromoles. Partir da curva padrão da atividade de protease amostras pode ser determinado em termos de unidades, que é a quantidade em micromoles de equivalentes de tirosina liberada a partir de caseína por minuto.

Para ver este artigo em chinês, clique aqui

Protocol

Antes de iniciar o ensaio, precisamos ter certeza de que os seguintes reagentes são corretamente preparado:

  1. Um tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7.5. Prepare com 11,4 mg / ml de fosfato de potássio dibásico, tri-hidratado em água purificada e ajustar o pH com HCl 1M. Esta solução é colocada a 37 ° C antes do uso.
  2. Uma solução de caseína de 0,65% peso / volume, preparada pela mistura de 6,5 mg / ml de caseína no tampão fosfato 50 mM de potássio. Aumentou gradualmente a temperatura da solução, com agitação suave para 80-85 ° C por aproximadamente 10 minutos até que uma dispersão homogênea é alcançado. É muito importante não ferver a solução. O pH é ajustado se necessário, com NaOH e HCl.
  3. A 110 mM Solução de ácido tricloroacético, preparada diluindo-se um estoque 6.1N 1:55 com água purificada. Ácido tricloroacético é um ácido forte e deve ser manuseado com cuidado.
  4. 0,5 mM Folin & Ciolcaltea, ou reagente fenol Folin, que é a solução que irá reagir com a tirosina para gerar uma mudança de cor mensuráveis ​​que estará diretamente relacionada à atividade de proteases. Reagente Fenol Folin é um ácido e deve ser manuseado com cuidado.
  5. A 500 mM solução de carbonato de sódio é preparada com 53 mg / ml de carbonato de sódio anyhydrous em água purificada.
    Uma solução diluente enzima, que consiste em 10 mM tampão acetato de sódio com acetato de cálcio 5mM, pH 7,5, a 37 ° C. Esta solução é o que usamos para dissolver amostras protease sólido ou soluções diluídas da enzima.
  6. 1,1 mM L-tirosina solução estoque padrão. Preparados com 0,2 mg / ml L-tirosina em água purificada e aquecida suavemente até a tirosina se dissolve. Tal como acontece com a caseína, não ferver esta solução. Permitir que o padrão L-tirosina para esfriar a temperatura ambiente. Esta solução será diluída mais para tornar a nossa curva padrão.
  7. Solução de protease. Imediatamente antes de usar, dissolver em solução diluente protease enzima preparada no passo 6.

Se necessário, use uma amostra sólida protease de atividade pré-determinada, que é dissolvido utilizando diluente enzima para 0,1-0,2 unidades / ml. Esta solução serve como um controle positivo para o ensaio controle de qualidade e como validação para os cálculos vamos realizar para determinar a atividade da enzima.

Configurando o Ensaio Protease e Curvas Padrão

  1. Para começar este ensaio, encontrar frascos adequados que irá realizar cerca de 15 mls. Para cada enzima que será testado, 4 frascos são necessários. Um frasco será usado como um espaço em branco, e outros três serão utilizados para a atividade de ensaio de três diluições da protease. Três diluições são úteis ao verificar cálculos finais uns contra os outros.
    1. Para cada conjunto de quatro frascos, adicione 5mls da nossa solução de caseína de 0,65%. Deixe que eles se equilibram em banho-maria a 37 ° C por aproximadamente 5 minutos.
    2. Adicionar variados volumes de solução de enzima que será testado para três dos frascos de amostra de teste, mas não o branco. Mix agitando e incubar por 37 ° C por exatamente 10 minutos. A atividade de protease e libertação conseqüentes de tirosina durante este tempo de incubação é o que vai ser medido e comparado entre as amostras de teste.
  2. Após esta incubação 10 minutos, adicione o 5 mls do reagente TCA a cada tubo para parar a reação. Em seguida, adicione um volume adequado de solução de enzima a cada tubo, mesmo em branco, para que o volume final da solução de enzima em cada tubo é de 1 ml. Isto é feito para dar conta do valor da absorbância da enzima em si e para garantir que o volume final em cada tubo é igual. Incubar as soluções a 37 ° C por 30 minutos.


    Durante esta incubação de 30 minutos, você pode querer configurar seu tirosina diluições padrão. Use dram 6 frascos (frascos dram pode ser substituído por tubos de polipropileno) que pode facilmente prender 8 mls. Aos seis frascos, adicione a 1,1 mM tirosina soluções estoque padrão com os seguintes volumes em mls: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Não adicione qualquer padrão de tirosina para o branco. Padrões mais baixos pode ser necessária para amostras impuras que trará mudança de cor pouco. Uma vez que a solução padrão de tirosina foi adicionado, adicione um volume adequado de água purificada a cada um dos padrões para obter um volume de 2 mls.
  3. Após a incubação de 30 minutos, filtrar cada uma das soluções de teste e os em branco usando uma seringa de 0,45 polietersulfona filtro. Filtração é necessária para remover qualquer insolúveis das amostras.
    1. Adicionar a filtração 2 mls das amostras teste e filtrado em branco para 4 frascos dram que pode conter pelo menos 8 mls. O mesmo tipo de frasco nas quais as normas foram elaboradas podem ser usados.
    2. A todos os frascos contendo as normas e padrão em branco, adicione 5mls de carbonato de sódio. Para melhores resultados, adicionar 1 ml de reagente de Folin imediatamente depois.
    3. Adicionar carbonato de sódio para regular qualquer queda pH criado pela adição de reagente de Folin o.
    4. Adicionar carbonato de sódio, as amostras de teste e test em branco. Essas soluções tornam-se nublado, após a adição de carbonato de sódio. Adicionar o reagente Folin, que vai reagir principalmente com tirosina livre.
    5. Misture os frascos dram por agitação e incubar a 37 ° C por 30 minutos.
    Após esta incubação, você deve observar que os padrões têm uma gradação de cor correlacionando-se com a quantidade de tirosina acrescentado; as maiores concentrações de tirosina mais escura aparecendo. Você pode notar também mudam de cor em amostras apreciável nosso teste. 2mls destas soluções são filtradas usando uma seringa de 0,45 polietersulfona filtro em cuvetes adequado. Agora que o ensaio é realizado, você pode avançar para o espectrofotômetro para gravar os nossos valores de absorbância.

Medição de absorbância e Calculando Atividade Enzimática

  1. A absorbância das amostras é medida por um espectrofotômetro usando um comprimento de onda de 660 nm. O caminho da luz é definida como um centímetro. Registrar os valores de absorbância para os padrões, em branco padrão, as amostras de teste diferentes, e ensaio em branco. Depois de todos os dados tenham sido coletados, a curva padrão pode ser criado. , A fim de gerar a curva de diferença, em absorbância entre o branco ea norma deve ser calculado. Este é o valor de absorbância atribuível à quantidade de tirosina nas soluções padrão. Após esse cálculo simples, criar a curva padrão, utilizando um programa gráfico para plotar a variação da absorvância de nossos padrões no eixo Y, em relação ao montante em micromoles para cada um dos nossos 5 normas sobre o eixo X.

    Volume de padrão de tirosina Tirosina uMoles
    0,05 0,055
    0,10 0,111
    0,20 0,221
    0,40 0,442
    0,50 0,553
  2. Depois de pontos de dados foram inseridos, geram uma linha de melhor ajuste e inclinação equação correspondente.


    Encontrar a variação de absorvância das amostras de teste através do cálculo da diferença entre a absorbância da amostra de teste ea absorbância do ensaio em branco. Inserindo o valor de absorbância para uma das amostras na equação inclinação e resolução resultará na micromoles de tirosina liberada durante esta reação proteolítica particular. Para obter a atividade da enzima em unidades por / ml, executar o seguinte cálculo:


    (Umole equivalentes tirosina liberada) x (11)
    Unidades / ml = Enzyme __________________________________________

    (1) x (10) x (2)


    11 = volume total (em mililitros) de ensaio
    10 = Tempo de ensaio (em minutos) de acordo com a definição da Unidade
    1 = Volume da enzima (em mililitros) de enzima usada
    2 = Volume (em mililitros) utilizados na determinação colorimétrica


    Tome o número de equivalentes micromoles tirosina liberados obtidos a partir da equação inclinação e multiplicá-lo pelo volume total do ensaio em mls, que no nosso caso é 11mls. Divida esse valor por três outras quantidades: o tempo do ensaio, que durou 10 minutos, o volume de enzima utilizada no ensaio, que foi variado (vamos usar 1ml), o volume de mililitros usado na detecção colorimétrica, o que pode diferem com base em seu cuvete. Nós usamos 2 mls.
  3. Micromoles de tirosina dividida pelo tempo em minutos de medição rendimentos da atividade da protease chamado de "unidades". Podemos cancelar as unidades de medição de volume no numerador e denominador, deixando um measurment da atividade enzimática em termos de unidades / ml. A fim de determinar a atividade em uma amostra sólida protease diluído em diluente enzima, dividimos a nossa actividade em unidades / ml pela concentração de sólidos utilizados neste ensaio originalmente em mg / ml., Deixando-nos com a atividade em termos de unidades / mg .


    Unidades / ml de enzima
    Unidades / mg sólida = _____________________

    mg sólido / ml de enzima

Discussion

Nós apenas mostramos como analisar a atividade da protease usando ensaio da Sigma atividade universal protease. Além disso, este ensaio é útil para garantir que nossos proteases têm precisamente determinada atividade antes de recebê-los para suas experiências. Como você viu, ao fazer este procedimento, é de fundamental importância para lembrar para aquecer tanto a caseína e soluções tirosina lentamente e não fervê-los. Além disso, é fundamental para preparar espaços diferentes para ambos os padrões do seu e para cada amostra de teste que você tem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Sigma-Aldrich P4630
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Casein Sigma-Aldrich C7078
Trichloroacetic Acid Sigma-Aldrich T0699
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent Sigma-Aldrich F9252
Sodium Carbonate, Anhydrous Sigma-Aldrich S2127
Sodium Acetate, Trihydrate Sigma-Aldrich S8625
Calcium Acetate Sigma-Aldrich C1000
L-Tyrosine, Free Base Sigma-Aldrich T3754
Protease Profiler Kit Sigma-Aldrich PP0500
Protease Fluorescent Detection Kit Sigma-Aldrich PF0100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
  2. Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).
Não-específicas da Sigma ensaio de atividade de protease - A caseína como substrato
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).More

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter