Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Sigmas Ospecifika Protease Activity-analys - Kasein som substrat

doi: 10.3791/899 Published: September 17, 2008

Summary

Proteaser bryta peptidbindningar. I labbet är det ofta nödvändigt att mäta och / eller jämföra aktiviteten hos proteaser. Sigmas icke-specifik proteas aktivitet analysen kan användas som ett standardiserat förfarande för att bestämma aktiviteten hos proteaser.

Abstract

Proteaser bryta peptidbindningar. I labbet är det ofta nödvändigt att mäta och / eller jämföra aktiviteten hos proteaser. Sigmas icke-specifik proteas aktivitet analysen kan användas som ett standardiserat förfarande för att bestämma aktiviteten hos proteaser, vilket är vad vi gör under våra rutiner för kvalitetskontroll. I denna analys fungerar kasein som substrat. När proteaset vi testar smälter kasein är aminosyran tyrosin befriades tillsammans med andra aminosyror och peptider fragment. Folin och Ciocalteus Fenol eller Folin reagens reagerar främst med fri tyrosin för att producera en blå kromofor, som är kvantifierbara och mäts som ett absorbansvärde på spektrofotometer. Ju mer tyrosin som avges från kasein, desto mer kromoforer genereras och ju starkare aktivitet proteas. Absorbansvärden som genereras av verksamheten i proteaset jämförs med en standardkurva, som genereras genom att reagera kända mängder av tyrosin med FC reagensen att korrelera förändringar i absorbans med mängden tyrosin i mikromol. Från standardkurvan aktivitet proteas prover kan bestämmas i termer av enheter, vilket är det belopp i mikromol tyrosin medel frigörs från kasein per minut.

För att se denna artikeln på kinesiska, klicka här

Protocol

Innan analysen påbörjas måste vi se till att följande reagenser är korrekt beredda:

  1. En 50 mM Kalium fosfatbuffert, pH 7,5. Förbered med 11,4 mg / ml kalium fosfatsyntasgen dibasiskt, trihydrat i renat vatten och justera pH med 1M HCl. Denna lösning är placerad i 37 ° C före användning.
  2. En 0,65% vikt / volym kasein lösning bereds genom att blanda 6,5 ​​mg / ml av kasein i 50 mM kalium fosfatbuffert. Successivt ökat lösningen temperaturen med varsam omrörning till 80-85 ° C i ca 10 minuter tills en homogen blandning uppnås. Det är mycket viktigt att inte koka lösningen. PH justeras sedan vid behov med NaOH och HCl.
  3. En 110 mm triklorättiksyrelösning, beredd genom utspädning en 6.1N lager 1:55 med renat vatten. Triklorättiksyra är en stark syra och bör hanteras med försiktighet.
  4. 0,5 mM Folin & Ciolcaltea s, eller Folin är Fenol reagens, som är den lösning som reagerar med tyrosin för att generera en mätbar färgförändring som kommer att vara direkt relaterade till aktiviteten av proteaser. Folin är Fenol Reagens är en syra och bör hanteras med försiktighet.
  5. En 500 mm Natriumkarbonatlösning, prepareras med 53 mg / ml anyhydrous natriumkarbonat i renat vatten.
    Ett enzym spädningsvätska lösning som består av 10 mm Natriumacetat Buffert med 5mm kalciumacetat, pH 7,5, vid 37 ° C. Denna lösning är vad vi använder för att lösa upp fasta proteas prover eller utspädd enzym lösningar.
  6. 1,1 mm L-tyrosin Standard stamlösning. Förberedd med 0,2 mg / ml L-tyrosin i renat vatten och värms försiktigt tills tyrosin löser sig. Precis som med kasein, inte koka inte denna lösning. Låt L-tyrosin standard svalna till rumstemperatur. Denna lösning kommer att spädas ytterligare för att göra vår standardkurvan.
  7. Proteas lösning. Omedelbart före användningen löses proteas i enzym spädningsvätska lösning som beretts i steg 6.

Om det behövs, använd en solid proteas urval av förutbestämd aktivitet, som upplöses med hjälp av enzymet spädningsvätska till 0,1-0,2 enheter / ml. Denna lösning fungerar som en positiv kontroll för kvalitetskontroll analysen och som validering för beräkningarna kommer vi att utföra för att bestämma enzymaktiviteten.

Ställa in Protease analys-och standardlösning Kurvor

  1. Till att börja denna analys, finna lämpliga injektionsflaskor som kommer att inneha cirka 15 MLS. För varje enzym som kommer att testas, 4 injektionsflaskor som behövs. En injektionsflaska kommer att användas som en tom, och tre andra kommer att användas för analys aktivitet tre utspädningar av proteas. Tre utspädningar är användbara vid kontroll slutliga beräkningarna mot varandra.
    1. För varje uppsättning om fyra flaskor, lägga 5mls av vår 0,65% kasein lösning. Låt dem i jämvikt i ett vattenbad vid 37 ° C i ca 5 minuter.
    2. Lägg varierande mängder enzym lösning som kommer att testas till tre av flaskorna provet, men inte tomt. Blanda genom att snurra och inkubera i 37 ° C i exakt tio minuter. Den proteas aktivitet och följdskador befrielsen av tyrosin under denna Inkubationstiden är vad som kommer att mätas och jämföras mellan proverna.
  2. Efter denna 10 minuters inkubation, tillsätt 5 ml av TCA reagens i varje rör för att stoppa reaktionen. Lägg sedan till en lämplig volym av enzymet lösning till varje rör, även de tomma, så att den slutliga volymen av enzymet lösning i varje rör är 1 ml. Detta görs för att redogöra för absorbansvärde av enzymet själva och se till att den slutliga volymen i rören är lika. Inkubera lösningar vid 37 ° C i 30 minuter.


    Under denna 30 minuters inkubation, kan du ställa in din tyrosin standard spädningar. Använd 6 DRAM flaskor (DRAM flaskor kan ersättas med polypropenrör) som lätt rymmer 8 MLS. Till de sex flaskorna, lägg till 1,1 mm tyrosin standard stamlösningar med följande volymer i MLS: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Lägg inte till någon tyrosin standard till det tomma. Lägre krav kan behövas för oren kontrollprover som kommer att ge lite färg förändring. När tyrosin standardlösningen har lagts till, lägg till en lämplig volym av renat vatten till varje av de standarder för att få volymen till 2 MLS.
  3. Efter 30 minuters inkubation, filtrera varje testlösningar och tom med en 0,45 um polyetersulfon spruta filter. Filtrering krävs för att ta bort eventuella olösligt material från prover.
    1. Tillsätt filtrering 2 ml av proverna och blank filtratet till 4 DRAM flaskor som rymmer minst 8 MLS. Samma typ av flaskan där standarderna förbereddes kan användas.
    2. Till alla flaskorna som innehåller de normer och standard tomt, lägg 5mls av natriumkarbonat. För bästa resultat, tillsätt 1 ml Folin reagens omedelbart efteråt.
    3. Lägg natriumkarbonat skall reglera pH-värdet sjunker som skapats genom tillägg av Folin reagens.
    4. Lägg natriumkarbonat på prov prov och TESt tomt. Dessa lösningar blir grumlig efter tillsats av natriumkarbonat. Lägg till Folin-reagens, som reagerar främst med gratis tyrosin.
    5. Blanda DRAM flaskorna genom att snurra och inkubera vid 37 ° C i 30 minuter.
    Efter inkuberingstiden bör du märka att standarder har en gradering av färg korrelera med mängden tyrosin läggas, de högsta halterna av tyrosin visas mörkaste. Du kan också märka märkbar färgförändring i våra prover. 2mls av dessa lösningar är filtrerade med hjälp av en 0,45 um polyetersulfon sprutfilter i lämpliga kyvetter. Nu när analysen utförs, kan du gå vidare till spektrofotometern att spela våra absorbansvärden.

Mäta absorbans och beräkna enzymaktiviteten

  1. Absorbansen av proverna mäts med en spektrofotometer med en våglängd på 660nm. Det ljusstrålen är inställd på 1 cm. Anteckna absorbansvärdena för standarderna, standard tomt, olika prover och testa tomt. När alla data har samlats in, kan standardkurvan skapas. För att skapa kurvan, skillnaden i absorbans mellan standard och standard tomt måste beräknas. Detta är absorptionsvärdet hänförlig till mängden tyrosin i standardlösningarna. Efter denna enkla beräkning skapa standardkurvan med hjälp av en grafritande program för att rita förändringen i absorbans av våra krav på Y-axeln, jämfört med beloppet i mikromol för alla våra 5 standarder på X-axeln.

    Volym av Tyrosin Standard uMoles Tyrosin
    0,05 0,055
    0,10 0,111
    0,20 0,221
    0,40 0,442
    0,50 0,553
  2. Efter datapunkter har matats in, generera en linje för bästa passform och motsvarande lutning ekvation.


    Hitta förändringen i absorbans i proverna genom att beräkna skillnaden mellan provets absorbans och absorbansen av testet tomt. Sätta in absorptionsvärdet för en av proverna i slänten ekvationen och lösa kommer att resultera i mikromol tyrosin befrias under denna proteolytiska reaktion. För att få aktiviteten av enzymet i enheter per / ml, utför följande beräkning:


    (Umole tyrosin medel frigörs) x (11)
    Enheter / ml Enzym = __________________________________________

    (1) x (10) x (2)


    11 = totala volymen (i milliliter) av den analys
    10 = Tid för analys (i minuter) per den enhet definitionen
    1 = volym av enzym (i milliliter) av enzym som används
    2 = Volym (i milliliter) som används i kolorimetri Fastställande


    Ta det antal mikromol tyrosin medel frigörs från backen ekvationen och multiplicera det med den totala volymen av analysen i MLS, som i vårt fall är 11mls. Dividera detta värde med tre andra kvantiteter tidpunkten för analysen, som vi körde i 10 minuter, vilket mängden enzym som används i analysen, varierades (låt oss använda 1 ml), volymen milliliter används i kolorimetriska upptäckt, vilket kan skiljer sig åt baserat på din kyvett. Vi använde 2 MLS.
  3. Mikromol tyrosin delat med tiden i minuter ger mätning av proteas aktivitet som kallas "enheter". Vi kan annullera de enheter för volymmätning i täljaren och nämnaren, vilket lämnar en uppmätning av enzymaktivitet i termer av enheter / ml. För att bestämma aktiviteten i fast proteas prov utspätt i enzymet lösningsmedel, delar vi vår verksamhet i enheter / ml med koncentrationen av solida som används i denna analys ursprungligen i mg / ml. Och lämnar oss med verksamheten i termer av enheter / mg .


    Enheter / ml enzym
    Enheter / mg fast = _____________________

    mg fast / ml enzym

Discussion

Vi har just visat dig hur man analyserar proteas aktivitet med hjälp av Sigmas universella analys proteas aktivitet. Dessutom är denna analys lämpligt att säkerställa att våra proteaser just har bestämt aktivitet innan du får dem för dina experiment. Som ni har sett, när du gör detta förfarande är det av största vikt att komma ihåg att värma både kasein och tyrosin lösningar långsamt och att inte koka dem. Dessutom är det viktigt att förbereda sig olika ämnen för både standard och för varje prov som du har.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protease Sigma-Aldrich P4630
Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Casein Sigma-Aldrich C7078
Trichloroacetic Acid Sigma-Aldrich T0699
Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent Sigma-Aldrich F9252
Sodium Carbonate, Anhydrous Sigma-Aldrich S2127
Sodium Acetate, Trihydrate Sigma-Aldrich S8625
Calcium Acetate Sigma-Aldrich C1000
L-Tyrosine, Free Base Sigma-Aldrich T3754
Protease Profiler Kit Sigma-Aldrich PP0500
Protease Fluorescent Detection Kit Sigma-Aldrich PF0100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).
  2. Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).
Sigmas Ospecifika Protease Activity-analys - Kasein som substrat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).More

Cupp-Enyard, C. Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate. J. Vis. Exp. (19), e899, doi:10.3791/899 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter