Summary
וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.
Abstract
עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, ולהפוך אותו כלי אידיאלי לחקר היווצרות של דפוסים, somite המוח, בצינור העצבי ואת primordia לב. יישומים של התרבות עובר אפרוח כוללים electroporation של בונה DNA או RNA על מנת לנתח את תפקיד הגן, שתלי של גורם גדילה חרוזים מצופים כגון FGFs ו BMPs, כמו גם הר שלם הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בתרבות עובר אפרוח: ראשית, העובר בתוך explanted מלוחים. ואז, העובר מתמקדת טבעת זכוכית. קרום המקיף את העובר הם הרים לאורך קירות של הטבעת. הטבעת ממוקמת כך בצלחת תרבות המכיל מאגר של albumine. המנה תרבות אטום והניחו בתא לח, שבו העובר הוא תרבותי של עד 24 שעות. לבסוף, העובר יוסר הטבעת, קבוע ומעובדים עבור יישומים נוספים. מדריך לפתרון בעיות מוצג גם.
Protocol
חלק 1: ספסל להגדיר
- חדר לח מוכן ידי הצבת Kimwipe / DDH 2 O בתא פלסטיק.
- צינור פלקון לאסוף אלבומין, מנות לתרבות, טבעות, watchglass וסילוק פסולת ממוקמות על הספסל.
- צלחת פיירקס מלא מלוחים 1.4 l (ראה הערות [א]).
חלק 2: העובר explanted ב מלוחים
- ביצים יוסרו מן החממה לאחר 16 שעות (שלב 4). ביצה היא opene ידי הקשה על פגז עם מלקחיים. פיסות מעטפת יוסרו.
- אלבומין דק נאסף בצינור פלקון. אלבומין עבה יוסר עם מלקחיים.
- העובר ממוקם צלחת פלסטיק בתוך צלחת מלוחים. אלבומין הנותרים יוסר עם מלקחיים.
חלק 3: העובר במרכז הטבעת
- שק חלמון מוטה עם מלקחיים כך העובר הפונה כלפי מעלה.
- שק החלמון הוא חתך ברמה של קו המשווה או למטה.
- בעזרת מלקחיים בסדר, קרום vitelline הוא קילף במהירות. הממברנה vitelline מכוונת כך לצד גרגרי שלה (shinny הלא) הפנים כלפי מעלה.
- בעזרת מלקחיים בסדר, קרום vitelline מושם על זכוכית השעון.
- בעזרת מלקחיים בסדר, טבעת זכוכית מוחל על גבי קרום vitelline ואת העובר במרכז.
- הממברנה vitelline הוא הרים סביב הקצוות של טבעת הזכוכית. האסיפה יוסר המנה מלוחים.
חלק 4: תרבות מוגדרת תחת מיקרוסקופ
- הממברנה vitelline יוסר מעל טבעת הזכוכית באמצעות מלקחיים קנס תחת מיקרוסקופ.
- בעזרת פיפטה פסטר, מלוחים נמחקת בקצה החיצוני של הטבעת.
- בעזרת מספריים בסדר, עודף קרום vitelline מוסר מהקצה הפנימי של טבעת הזכוכית. הטיפול נלקח לא לחדור קרום עם פיפטה או מלקחיים.
- העובר היא שטפה בעדינות עם מלח כדי להסיר את ממברנות התאים רופף חלמון.
- 200 μl מלוחים מתווסף הקצה החיצוני של טבעת (זה יקל על העברת מאוחר יותר).
- הרכבה מכוסה עם צלחת פלסטיק הפוכה.
חלק 5: תרבות מועבר חממה
- צלחת תרבות פלקון מסומן.
- 2.5ml של אלבומין דק נוסף בתחתית המנה פלקון.
- 200μl של אלבומין דק מתווסף לקצה הפנימי של המכסה של המנה פלקון.
- צלחת הפוכה יוסר הרכבה.
- בעזרת מלקחיים בסדר, טבעת הזכוכית slided בשולי זכוכית השעון, והועבר המנה פלקון.
- מלוחים כל שנותר הוא להסיר את המשטח הפנימי של הטבעת.
- המנה פלקון מכוסה במכסה וחתום.
- הרכבה ממוקם בתא לח ואז בחממה.
- הם עוברים בתרבית עד 24 שעות ב 38 ° C.
חלק 6: בעקבות התרבות, העובר הוא קבוע; תרבות מועבר חממה
- צלחת קיבוע מלא קר כקרח PBS (או depc-PBS אם הם עוברים להיות מעובד שכן הכלאה באתרו).
- התרבות היא להסיר את האינקובטור והניח מיד על הקרח. המנה תרבות מלא מיד עם קרים כקרח PBS / depc-PBS.
- העובר מנותקת הממברנה vitelline. העובר מועבר המנה קיבעון, באמצעות הקצה הקהה של פיפטה פסטר.
- העובר הוא מרותקים באמצעות בוטה, הסתיים מלקחיים בסדר. PBS מכסה את המנה קיבעון מוסר. מיצב נוסף (ראה הערות [b]).
- בהתאם ליישום, העובר הוא קבוע עבור שעות 6-8 ב 4 ° C (cryostat), O / N ב 4 ° C (ב מנח), או 1 שעות ב RT עבור אימונוהיסטוכימיה הר שלם.
- מקבע היא להסיר והחליפו עם קרים כקרח PBS / depc PBS.
- עבור יישומים במורד הזרם כמו הכלאה באתרו או מכתים immantibody: מערכת העצבים והלב הם מחורר באמצעות מחט סוף בוטה microcapillary או סכין microdissection, זה ימנע השמנה של בדיקה / נוגדן צעדים מאוחר יותר.
הערות: [א] מלוחים כולל: פתרון (עבור l 1): 121.0 גרם NaCl, KCl 15.5 גרם, 10.4 גרם CaCl 2 .2 H 2 O, 12.7 גרם MgCl 2 0.6 H 2 O; פתרון B (עבור l 1) : 2.4 גרם Na 2 HPO 4 .2 H 2 O, 0.2 גרם לאא 2 PO 4 .2 H 2 O; החיטוי, לפני השימוש, לערבב 120 מ"ל עם 2700 מ"ל H 2 O: הוסף 180 מ"ל ב מיקס [1]; [b] מקבע מוכן רק לפני השימוש (4% PFA ב PBS או depc-PBS על מנח ב).
חלק 7: תוצאות נציג
לפני התרבות, העובר נמצא בשלב פרימיטיבי פס (HH4). בסוף התקופה, תרבות, העובר התפתח HH10 (אורך 2-3 מ"מ) גלוי במרכז צלחת את התרבות. אפשר תווית קבוצת תאים עם carbocyanine DiI פלורסנטבדיוק לפני התרבות (0h) ופעל תנועתם לאורך כל התקופה והתרבות. במקרה זה, התאים מתחת הצומת של Hensen (ח"נ) תויגו עם DiI. תאים אלה מוצגים לתרום somites בהדרגה מתפתחות (סום) ו notochord (n). 
חלק 8: פתרון בעיות
| בעיה | לגרום | תרופה |
|---|---|---|
| העובר נשאר עם חלמון במקום יורד עם קרום (שלב 2) | מסכן איכות הביצית | בקש מיוצר טרי ביצים, ביצים חנות ב 13 ° C עם קבלת. דגירה הביצים יום זהה לתאריך ההגעה. |
| Vitelline שקופיות קרום מן המיקום של שען הבאים כוס טבעת (שלב 3) | אלבומין שרידי | בשלב 2, לוודא שכל אלבומין יוסר ידי משיכתו הרחק קרום עם מלקחיים מוטה |
| העובר אינו נגיש: טמון מתחת הממברנה (שלב 4) | מהצד הלא נכון של הממברנה הוא כלפי מעלה | בשלב 3, יש לוודא את הצד של הקרום המכיל גרגרי חלמון פונה מעלה. הצד המבריק, מלוטש צריך הפנים כלפי מטה. |
| העובר שקועים בתרבות הבאים מלוחים / אלבומין (שלב 6) | חור בקרום; מלוחים / אלבומין שמאל בתוך טבעת לפני התרבות | בשלב 5, לוודא שכל אלבומין / מלוחים יוסר בתוך הטבעת, בשלב 4, הקפד לא לחדור קרום עם מלקחיים (להשתמש במלקחיים בוטה הסתיים) |
| העובר התפרקה בעקבות תרבות | זיהום בקטריאלי | לעקר את כל כלי וכלי זכוכית, שימוש באנטיביוטיקה / antimycotic |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה תרבות חדשה 2 יכולים לשמש למגוון רחב של יישומים, החל שתלי של גורם גדילה המכיל חרוזים 3, אל הר שלמה הכלאה באתרו כל אימונוהיסטוכימיה הר 4. התרבות במשך 24 שעות מאפשרת ניטור רציף של ההתפתחות העוברית ביישומים כגון ניתוח זמן לשגות תנועת התא 5 או ניטור של ה-GFP המכיל בונה electroporated 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מ 'מרגרט Alkek קרן אל RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
