Summary
Bu video Yeni kültür, civciv embriyolarının 24 saat kadar yumurta dışında kültür olan bir yöntem gösteriyor. Bu yöntem, erken gelişme (14 som ilkel bir çizgi.) Fare E7-9 karşılık gelen bir süre çalışma sağlar. In situ hibridizasyon ve immünohistokimya, bu tekniğin Uygulamaları elektroporasyon içerir.
Abstract
Civciv embriyo erken embriyonik gelişim çalışmaya değerli bir araçtır. Şeffaflığı, erişilebilirliği ve kolay manipülasyon, bu oluşumu ve beyin, nöral tüp, hücre gruplarının ve kalp primordia desenlendirme eğitimi için ideal bir araçtır. Uygulamaları civciv embriyo kültürü, in situ hibridizasyon ve immünohistokimya, gen fonksiyonu, FGFs ve BMP gibi büyüme faktörü kaplı boncuklar greft yanı sıra tüm montaj analiz etmek için DNA veya RNA yapıları elektroporasyon içerir. Bu video civciv embriyo kültürü farklı adımları gösteriyor; İlk olarak, embriyo tuzlu su eksplante. Sonra, embriyo bir cam yüzük ortalanır. Embriyo çevreleyen zarların halka duvarları boyunca kaldırılır. Bu halka daha sonra, albümin bir havuzun bulunduğu bir kültür tabak içinde yer alır. 24 saat kadar embriyo kültür olduğu kültür çanak, kapalı ve nemli odasında yerleştirilir. Son olarak, embriyo, ring kaldırılır, sabit ve başka uygulamalar için işlenmiş. Bir sorun giderme kılavuzu da sunulmaktadır.
Protocol
Bölüm 1: Tezgah kurmak
- Nemli odasına plastik odasında Kimwipe / GKD 2 O koyarak hazırlanır.
- Falcon tüp albümin, kültür, yüzük, Dürbün ve atık bertarafı için yemekleri toplamak için bir tezgah üzerine yerleştirilir.
- Kabına 1.4 lt tuzlu su ile dolu (notlara bakınız [a]).
Bölüm 2: Embriyo tuzlu eksplante
- Yumurta, 16 saat sonra (evre 4) inkübatör kaldırılır. Yumurta kabuk forseps ile dokunarak opene. Shell adet kaldırılır.
- Ince albümin Falcon tüp toplanır. Kalın albümin forseps ile kaldırılır.
- Embriyo tuzlu çanak içinde plastik bir tabak içinde yer alır. Kalan albumin forseps ile temizlenebilir.
Bölüm 3: Embriyo halka merkezli
- Yolk kesesi, embriyo yukarı bakacak şekilde forseps ile hareket ettirildiğinde.
- Yolk kesesi ekvator düzeyinde veya altında kesilir.
- Vitellin membran ince forseps kullanarak, hızlı bir şekilde soyulur. Vitellin membran granüler tarafında (parlak ama) yukarı bakacak şekilde aydınlatmaktadır.
- Vitellin membran ince forseps kullanarak, saat camı üzerine yerleştirilir.
- Ince forseps kullanarak, bir cam yüzük vitellin membran üstüne uygulanır ve embriyo ortalanır.
- Vitellin membran cam halka kenarlarında kaldırdı. Montaj tuzlu çanak kaldırılır.
Bölüm 4: kültür mikroskop altında kurulur
- Vitellin membran cam, mikroskop altında ince forseps kullanarak halka üzerinden kaldırdı.
- Pasteur pipeti kullanarak, tuzlu su, dış ring kenarından kaldırıldı.
- Ince makas kullanmak, aşırı vitellin membran, iç cam ring kenarından kaldırılır. Bakım pipet veya forseps ile membran delmek için alınır.
- Embriyo hafifçe gevşek membranlar ve yumurta sarısı hücreleri temizlemek için tuzlu su ile durulanır.
- 200 ul tuzlu su halkası (bu daha sonra transferi kolaylaştıracak) dış kenarına eklenir.
- Montaj, ters bir plastik tabak ile kaplıdır.
Bölüm 5: kültür inkübatör aktarılır
- Falcon kültürü çanak etiketlenir.
- Ince albümin 2.5ml Falcon çanak altına eklenir.
- Ince albümin 200μl Falcon çanak kapağın iç kenarına eklenir.
- Ters çanak montaj kaldırılır.
- Ince forseps kullanarak, cam halka izlemek cam kenarı boyunca slided ve Falcon çanak aktarılır.
- Geri kalan tüm tuzlu su halka iç yüzeyine çıkarılır.
- Falcon çanak kapağı kapalı ve mühürlü.
- Montaj nemli odasında ve daha sonra inkübatöre yerleştirilir.
- Embriyoların 38 ° C'de 24 saat için kültür.
Bölüm 6: Aşağıdaki kültürü, embriyo sabittir; kültür inkübatör aktarılır
- (Embriyolar in situ hibridizasyon için işlenmek üzere iseniz veya depc-PBS) fiksasyon çanak buz gibi soğuk PBS ile doludur.
- Kültür inkübatör çıkartılıp hemen buz üzerinde yerleştirilir. Kültür çanak hemen buz gibi soğuk PBS / depc-PBS ile doludur.
- Embriyo vitellin membran kopuk. Embriyo Pasteur pipeti küt ucunu kullanarak, fiksasyon çanak aktarılır.
- Embriyo künt uçlu ince forseps kullanarak aşağı tutturulmuş. Fiksasyon çanak kapsayan PBS kaldırılır. Sabitleme eklendi [b] (notlara bakınız).
- Uygulamaya bağlı olarak, embriyo 4 6-8 saat süreyle sabit ° C (Kriyostat), O / N 4 ° C (situs), ya da tüm montaj immünohistokimya RT az 1 saat.
- Fiksatif buz gibi soğuk PBS / depc PBS ile kaldırılır ve değiştirilir.
- In situ hibridizasyon veya immantibody boyama gibi alt uygulamalar için: sinir sistemi ve kalp, künt bir ucunu microcapillary iğne veya mikrodiseksiyon bıçak kullanarak delikli, bu daha sonraki adımda prob / antikor yakalama önleyecektir .
Notlar: [a] Tuzlu oluşur: çözümü (1 lt): 121,0 g NaCl, 15.5 g KCl, 10.4 g CaCl 2 .2 H 2 O, 12,7 g MgCl 2 .6 H 2 O; B çözeltisi (1 litre) : 2.4 g Na 2 HPO 4 .2 H 2 O, 0.2 g NaH 2 PO 4 .2 H 2 O; Otoklav; Kullanmadan önce, 120 ml karıştırmak, 2700 ml H 2 O ile 180 ml B. Mix [1] ; [b] Sabitleme (% 4 situs için PBS veya depc-PBS PFA) kullanımdan hemen önce hazırlanır.
Bölüm 7: Temsilci Sonuçlar
Embriyo kültür öncesinde, ilkel bir çizgi evre (HH4). Kültür dönemi sonunda, embriyo HH10 (2-3 mm uzunluğunda) geliştirilen ve kültür çanak merkezi görünür. Hücrelerden oluşan bir grup floresan DII carbocyanine etiket mümkündürSadece kültür önce (0h) ve kültür dönemi boyunca hareketini takip. Bu durumda, Hensen düğüm (HN) altındaki hücreler DII ile etiketlenir. Bu hücreler kademeli olarak gelişmekte olan Somitlerin (som) ve notokord (n) katkıda bulunmak için gösterilmiştir. 
Bölüm 8: Sorun Giderme
| Sorun | Neden | Çare |
|---|---|---|
| Embriyo membran (adım 2) çıkıyorsa yerine sarısı ile kalır | Yumurta kalitesi zayıf | Mağaza yumurta aldıktan sonra 13 ° C; İstek taze yumurta üretilmektedir. Yumurta geliş tarihi aynı gün inkübe edin. |
| Vitellin membran slayt halka saatçilik cam aşağıdaki yerleştirme (3. adım) | Albumin kalıntıları | 2. adımda, tüm albümin eğimli forseps membran çekerek kaldırıldığını emin olun |
| Embriyo erişilemez: membran altında yatıyor (adım 4) | Membran yanlış tarafında yukarı doğru | 3. adımda, sarısı granülleri içeren membran tarafı yukarı bakacak şekilde emin olun. Parlak, cilalı yan aşağı bakmalıdır. |
| Embriyo (adım 6), tuzlu albümin / kültür sular altında | Tuzlu önce kültür halkasının içinde sol albümin /; zarı delik | 5. adımda, tuzlu / tüm albümin halkasının içinde kaldırılır olduğunu emin olun; 4. adımda, (künt sona erdi forseps kullanımı) forseps ile delmek membran yok emin olun |
| Embriyo aşağıdaki kültür parçalandı | Bakteriyel enfeksiyon | Antimikotik / antibiyotik tüm alet ve cam sterilize; kullanın. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yeni kültür yöntemi 2 büyüme faktörü tüm montaj boncuk 3, in situ hibridizasyon ve tüm montaj immünohistokimya 4 içeren greftleri arasında değişen çok çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir. 24 saatlik süre içinde Kültür embriyonik gelişim zaman atlamalı hücre hareket analizi 5 veya GFP 6 electroporated yapıları içeren izleme gibi uygulamalar sürekli olarak izlenmesini sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Margaret M. RHF Alkek Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Robbins Scientific, SciGene | M1000 | |
| Pyrex dish (2) | Tool | |||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR international | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Surgery | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Sharpening Stone Dan’s Black Arkansas | Surgery | Electron Microscopy Sciences | 62082-00 | |
| Fine scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microcapillary tube | Surgery | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps |
| Microdissecting knife | Surgery | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Surgery | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
References
- Pannett, P. A., Compton, C. A. The cultivation of tissues in saline. Lancet. 206, 381-384 (1924).
- New, D. T. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morph. 3, 326-331 (1955).
- Alvarez, I. S., Araujo, M., Nieto, M. A. Neural induction in whole chick embryo cultures by FGF. Dev. Biol. 199, 42-54 (1998).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo. Development. 122, 1523-1534 (1996).
- Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protoc. 3, 419-426 (2008).
